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目的:为早产儿提供氧气是临床上广泛应用的治疗措施,但长时间高氧治疗会对机体多个器官造成不可逆的损伤。高浓度的氧气会破坏小肠绒毛结构,影响肠道屏障功能,使早产儿易患坏死性小肠结肠炎。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路广泛存在于细胞质中。哺乳动物MAPK信号通路主要包括:细胞外信号调节激酶（extracellular signal-related kinases,ERK）、P38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）。MAPK信号通路可以被多种细胞外刺激激活参与细胞凋亡,分化,增殖等病理生理过程。细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）属于MAPK激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK）家族成员,在诱导细胞死亡,分化和炎性细胞因子的产生等多种机制中具有关键作用。然而ASK1/MAPK途径是否参与高氧对肠上皮细胞造成的损伤尚不明确。高氧条件下,氧化应激是造成肠上皮细胞损伤的主要原因。核转录因子E2-相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作为细胞对氧化应激的主要应答者,在氧化应激发生后,Nrf2-kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,keap1）途径被激活,高氧诱导肠上皮细胞分泌大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）,过量的ROS引起keap1构象改变,游离的Nrf2转移至细胞核中发挥作用。白细胞介素17D（interleukin 17D,IL-17D）在多种组织和细胞中均有表达,它在免疫反应中的作用是复杂的,IL-17D不仅可以诱导内皮细胞产生细胞因子间接调节免疫应答,还在Nrf2的调控下发挥抗感染以及抗肿瘤免疫作用。但高氧环境中肠上皮细胞IL-17D的表达变化以及Nrf2是否调节IL-17D的表达尚不明确。因此,本研究旨在通过检测ROS对肠上皮细胞内ASK1/MAPK途径的影响,明确高氧对肠上皮细胞造成损伤的作用机制;通过检测高氧对新生大鼠肠道IL-17D,Nrf2和keap1表达的影响,了解Nrf2对IL-17D表达的调节作用;细胞水平上,通过检测高氧环境中肠上皮细胞IL-17D,Nrf2,keap1,IL-4和IL-6的表达以及加入Nrf2激动剂和抑制剂后这些因子的变化,进一步探究Nrf2对IL-17D的调节作用以及Nrf2/IL-17D轴是否参与高氧诱导的肠上皮细胞炎症反应,为预防临床高氧治疗过程中的不良反应提供了理论依据。研究方法:1.细胞培养:Caco-2细胞培养在正常细胞孵育箱（5%CO2,37℃）中,细胞传代后继续培养24小时,用不同浓度H2O2（100μm、200μm和400μm）和85%O2（5%CO2,85%O2,37℃）孵育24小时;NCM460细胞培养在正常细胞孵育箱（5%CO2,37℃）中,细胞传代后继续培养24小时,随机取一部分放入高氧孵育箱（5%CO2,85%O2,37℃）中继续培养24,48和72小时,另一部分加入Nrf2激动剂和抑制剂后放入高氧孵育箱（5%CO2,85%O2,37℃）中继续培养24,48和72小时。2.利用免疫荧光染色检测Caco-2细胞中ASK1的表达。3.利用Western Blot和实时定量荧光逆转录聚合酶链式反应（quantitative Real-time Fluorescent Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）检测ERK、p-ERK、P38、p-P38、JNK和p-JNK的表达变化。4.制备动物模型:将新生大鼠在出生后12小时内随机分为对照组（Fi O2=20%）和模型组（Fi O2=85%）,于出生后的第3、7、10和14天,收集小肠组织。5.利用免疫荧光染色检测IL-17D在新生大鼠肠黏膜中的表达定位。6.通过免疫组织化学染色,Western Blot检测新生大鼠肠黏膜Nrf2、IL-17D和keap1的表达变化。7.利用免疫细胞化学染色、Western blot和q RT-PCR检测高氧培养的NCM460细胞中Nrf2、IL-17D、keap1、IL-4和IL-6的表达。8.利用Western blot检测加入Nrf2激动剂和抑制剂后培养于高氧的NCM460细胞中Nrf2、IL-17D、keap1、IL-4和IL-6的表达。结果:1.ROS对肠上皮细胞中ASK1/MAPK通路的影响:（1）用不同浓度的H2O2和高氧处理后,肠上皮细胞ASK1从细胞质迁移到细胞核,并且H2O2对ASK1的表达具有剂量依赖作用。与未处理或H2O2处理的细胞相比,高氧培养的细胞中ASK1表达更高。（2）Western blot和q RT-PCR结果显示,与对照组相比,不同浓度H2O2和高氧处理后,ERK、p-ERK、JNK、P-JNK、P38和p-P38蛋白和m RNA的表达逐渐升高（P<0.05或P<0.01）,但仍低于高氧诱导后的表达水平（P<0.01）。2.高氧对新生大鼠小肠Nrf2、IL-17D和keap1表达的影响:（1）免疫组化染色和Western blot结果显示,与对照组相比,模型组中Nrf2和IL-17D的表达在第7天增加并达到峰值（P<0.01）;而在第10天和第14天逐渐减少并显著低于对照组（P<0.01）;但在第3天和第7天,模型组keap1的表达显著低于对照组（P<0.01）。（2）免疫组织荧光染色结果显示,IL-17D在模型组和对照组的肠上皮细胞以及CD4+T细胞和CD19+B细胞中均有表达。3.高氧对肠上皮细胞IL-17D、Nrf2、keap1、IL-4和IL-6表达的影响:与对照组相比,高氧组肠上皮细胞IL-17D、Nrf2、IL-4和IL-6的表达显著增加（P<0.01）,并且随着高氧培养时间的延长,IL-17D、Nrf2、IL-4和IL-6的表达呈递增趋势（P<0.01）;而高氧组细胞keap1的表达低于对照组（P<0.01）,并且随着高氧培养时间的延长,keap1蛋白表达呈递减趋势（P<0.01）。4.t BHQ（20μM）对高氧中肠上皮细胞IL-17D、Nrf2、IL-4和IL-6表达的影响:与高氧组相比,IL-17D、Nrf2、IL-4和IL-6的表达随着t BHQ作用时间的延长逐渐增加（P<0.01或P<0.05）,但与高氧组相比,keap1表达无明显变化。5.ML385（10μM）对高氧条件下肠上皮细胞IL-17D、Nrf2、IL-4和IL-6表达的影响:与高氧组相比,IL-17D和Nrf2表达随着ML385作用时间的延长呈下降趋势（P<0.01）,但keap1的表达水平没有显著变化;ML385在24h和48h显著抑制IL-6和IL-4的产生,但在72h,抑制作用部分丧失,IL-6和IL-4的表达再次上升（P<0.01）。结论:1.高氧通过ROS激活ASK1/MAPK信号通路损伤肠上皮细胞。2.高氧通过MAPK通路激活Nrf2,Nrf2诱导IL-17D的表达增加,加重肠上皮细胞炎症反应。