论文部分内容阅读
目的:儿童肥胖影响青春期发育已经引起广泛关注,儿童肥胖引起女童青春期发育提前,但对男童青春期发育影响还不明确,同时机制尚不清楚。最新研究发现miRNAs可能与青春期发育密切相关,其中miR-30因其可通过调控MNRN3进而影响下丘脑-垂体-性腺轴中Gn RH分泌引起关注,肥胖时下丘脑miR-30表达升高,是否miR-30在青春期前肥胖影响青春期发育中起重要作用值得深入探讨。本次通过建立青春期前肥胖模型,探讨miR-30/MKRN3/Kisspeptin通路在青春期前肥胖影响小鼠青春期发育中的作用,为肥胖影响青春期发育机制的探讨提供科学依据。方法:选取C57BL/6J雄性24只和雌性小鼠48只,适应性喂养7天后按1:2配对合笼,出生后的仔鼠,随机选取雄性和雌性小鼠各48只。48只雄性小鼠分为高脂组(High fat diet group,HFD)和对照组(Control group,CONT),每组各24只。雌鼠同雄鼠。15日龄青春期前肥胖模型建立方法:HFD组以60%高脂饲料喂养哺乳期母鼠15日;CONT组母鼠饲以普通饲料。45日龄青春期肥胖模型建立方法:HFD组以60%高脂饲料喂养哺乳期母鼠21日,21日龄仔鼠断乳后继续60%高脂饲料喂养,共饲养45日;CONT组母鼠和仔鼠都饲以普通饲料。仔鼠分别与出生后15日和45日(48只/次,雌雄各半)麻醉后处死,建立青春期前肥胖模型。自小鼠28日龄,每日检测雄性阴茎剥离程度,雌性阴道开口时间,两日称量体重一次。实验15日,采用Western Blot方法检测下丘脑蛋白表达水平;q RT-PCR方法检测下丘脑基因表达水平。实验45日,检测雄性小鼠精子数量和活动度;电镜和光镜观察雄性睾丸间质细胞,雌性卵泡数量和雌性的卵巢的病理改变;ELISA方法检测血清中雄、雌激素和LH水平;采用免疫组化方法检测下丘脑Gn RH蛋白表达水平;采用Western Blot方法检测下丘脑MKRN3、NKB、Kisspeptin蛋白表达水平;q RT-PCR方法检测下丘脑miR-30、MKRN3、Tac3、Kiss-1和Gn RH基因表达水平。结果:1、15日龄HFD组雌鼠与CONT组雌鼠相比下丘脑miR-30b表达显著升高(P<0.05)。2、45日龄小鼠,从21日断乳开始至45日,雄、雌小鼠HFD组体重显著高于CONT组(P<0.05)。3、实验45日时,雄、雌小鼠HFD组体脂肪、体脂肪百分比和瘦体重均显著高于CONT组(P<0.05),雌鼠HFD组瘦体重百分比显著低于CONT组(P<0.05);雄鼠HFD组的肾周脂肪重量、肾周脂肪系数和性腺脂肪重量与CONT相比均显著升高(P<0.05),雌鼠HFD组的肾周脂肪系数、性腺脂肪重量和性腺脂肪系数与CONT相比均显著升高(P<0.05)。4、实验45日时,雄鼠HFD组的睾丸重量、附睾重量、附睾系数、肝脏重量、肾脏重量和肾脏系数与CONT组相比均显著升高(P<0.05),而雄鼠HFD组的睾丸系数和肝脏系数与CONT组相比均显著降低(P<0.05);雌鼠HFD组的卵巢重量、卵巢系数、子宫重量、子宫系数、肾脏重量和肾脏系数与CONT组相比均显著升高(P<0.05),雌鼠HFD组的肝脏系数与CONT组相比均显著降低(P<0.05)。5、HFD组雄、雌鼠青春期启动时间比CONT组显著提前(P<0.05)。6、实验45日时,与CONT组相比,雄鼠HFD组的精子数、精子活动度显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);雄鼠HFD组的精子畸形率显著高于CONT组(P<0.05)。7、实验45日时,光镜发现雄性HFD组睾丸生精小管排列不规则且疏松,其中可见很多精子;雌性HFD组小鼠卵巢的卵泡数量增多,各级卵泡发育良好,核仁明显,黄体数量明显增加。8、实验45日时,电镜观察到,雄性HFD组小鼠睾丸间质细胞中细胞核较小,核染色质均匀,核周围围绕大量脂滴,细胞质中可见较多成熟精子;雌性HFD组卵巢细胞中卵巢结构完整,线粒体、溶酶体和内质网等细胞器较多,细胞质及间质中可见大量脂滴。9、实验45日时,雄鼠HFD组血清睾酮、黄体生成素水平显著高于CONT组(P<0.05);与CONT组相比,雌鼠HFD组血清雌二醇、黄体生成素水平显著升高(P<0.05)。10、实验45日时,与CONT组相比,雄、雌鼠HFD组下丘脑Gn RH阳性颗粒面积显著增加,雄、雌小鼠HFD组下丘脑Gn RH蛋白表达显著高于对照组(P<0.05);HFD组雌、雄小鼠下丘脑Gn RH m RNA表达显著高于对照组(P<0.05)。11、实验45日时,雄、雌鼠HFD组下丘脑MKRN3蛋白表达水平显著低于CONT组(P<0.05),而NKB、Kisspeptin和GPR54蛋白表达水平显著高于CONT组(P<0.05);雄、雌鼠HFD组下丘脑miR-30b、Tac3、Kiss-1和GPR54 m RNA表达水平显著高于CONT组(P<0.05),而MKRN3 m RNA表达水平显著低于CONT组(P<0.05)。结论:1、雄性和雌性肥胖小鼠青春期启动提前。2、青春期前下丘脑中miR-30表达升高,进而引起MKRN3表达降低,以及NKB、Kisspeptin和Gn RH表达升高,导致LH和雄激素(雄鼠)或雌激素(雌鼠)的水平升高,可能是肥胖引起雄性和雌性小鼠青春期启动提前的重要原因。