目的基于前期研究发现“调更汤”能够改善下丘脑氧化损伤、延缓下丘脑神经组织衰老的结果,本实验通过动物实验及细胞实验研究“调更汤”改善下丘脑神经元细胞凋亡发挥中枢神经保护作用,及其调控ASK1/MKK7/JNK信号通路发挥抗凋亡作用的分子机制,阐释“调更汤”治疗绝经综合征的可能机理,为推广“调更汤”的临床应用提供科学依据。方法动物实验:120只SPF级4月龄雌性SD大鼠,分为假手术组（Sham）、去势手术组（OVX）、戊酸雌二醇组（OVX+Ev）、调更汤低剂量组（OVX+TG 9.69g）、调更汤中剂量组（OVX+TG 19.37g）及调更汤高剂量组（OVX+TG 38.74g）六个组。适应性饲养一周后,一组行假手术,另外五组切除双侧卵巢。造模成功后,Sham组及OVX组给予生理盐水灌胃,OVX+Ev组给予戊酸雌二醇（0.12 mg/kg）灌胃,调更汤低、中、高剂量组分别给予三种不同剂量的中药调更汤灌胃。治疗4周后,运用Nissl染色法观察下丘脑神经细胞病理形态学改变;运用透射电子显微镜观察下丘脑神经细胞的超微结构改变;运用TUNEL染色法检测下丘脑神经细胞凋亡率;运用q RT-PCR技术和Western blot技术检测Bcl-2家族基因及蛋白变化情况;运用Western blot技术检测ASK1/MKK7/JNK通路相关蛋白ASK1、MKK7、JNK、c-Jun、Casp3及其磷酸化的表达。细胞实验:将GT1-7下丘脑神经元细胞株传代2-3代。取处于生长对数期的GT1-7细胞随机2万细胞每孔铺板96孔板,CCK-8法筛选调更汤干预GT1-7细胞的浓度;取处于生长对数期的GT1-7细胞随机分为对照组（Con）,模型组（TBTC）,17β-E2组（17β-E2）,调更汤低剂量组（TG 31.25μg/m L）,调更汤中剂量组（TG 62.5μg/m L）及调更汤高剂量组（TG 125μg/m L）。CCK8法检测TBTC作用于GT1-7细胞活力实验;光镜下观察细胞形态;Hoechst33258染色法观察凋亡细胞核形态;Annexin V-FITC/PI双染色流式技术检测GT1-7细胞凋亡水平;TMT磷酸化修饰定量蛋白组学经生信分析相关通路及差异蛋白;应用q RT-PCR技术、Western blot技术检测Bcl-2、Bax基因及蛋白变化情况;运用Western blot技术检测ASK1/MKK7/JNK通路相关的蛋白ASK1、MKK7、JNK、c-Jun、Casp3及其磷酸化的表达。结果1.动物实验:1)Nissl染色结果表明,与Sham组相比较,OVX组下丘脑神经细胞的尼氏小体丧失,细胞核萎缩。与OVX组相比较,戊酸雌二醇组,调更汤中剂量组及调更汤高剂量组细胞核及尼氏小体形态恢复。2)透射电镜结果表明,与Sham组相比较,OVX组下丘脑神经细胞、线粒体、内质网的形态不完整,结构水肿变形,并存在大量的脂褐素沉积物。与OVX组相比较,戊酸雌二醇组和调更汤低、中、高剂量组大鼠下丘脑神经细胞超微结构均有不同程度的恢复,线粒体形态趋于椭圆,线粒体嵴趋于完好,内质网的水肿明显减轻,脂褐素的沉积也显著减少。3)TUNEL染色结果表明,与Sham组相比较,OVX组下丘脑中TUNEL阳性细胞的比率显著增加（P＜0.01）,与OVX组相比较,戊酸雌二醇组,调更汤中剂量组及调更汤高剂量组下丘脑中TUNEL阳性细胞的比率显着降低（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01）。4)q RT-PCR检测结果表明,OVX组大鼠下丘脑组织中Bax m RNA水平升高,Bcl-2 m RNA水平降低,Bcl-2/Bax比值为0.43（P＜0.01）。调更汤低、中、高剂量组和戊酸雌二醇组Bcl-2/Bax m RNA水平比值可显著高于OVX组（P＜0.01）。5)Western blot检测结果表明,与Sham组相比较,OVX组下丘脑中p-ASK1,p-MKK7,p-JNK,p-c-Jun和CL-Casp3蛋白表达显著升高（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）;与OVX组相比较,戊酸雌二醇组p-ASK1,p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01）,p-MKK7及p-c-Jun蛋白表达呈下降趋势（P＞0.05）;调更汤低剂量组p-ASK1及CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01）;调更汤中剂量组p-ASK1,p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）;调更汤高剂量组p-ASK1,p-MKK7,p-JNK,p-c-Jun,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。与Sham组相比较,OVX组下丘脑Bcl-2/Bax蛋白比值显著降低（P＜0.01）。与OVX组相比较,戊酸雌二醇组,调更汤低、中、高剂量组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。2.细胞实验:1)CCK8实验结果表明:选择调更汤干预浓度:与Con组相比较,调更汤31.25,62.5,125μg/m L处理GT1-7神经元细胞后,GT1-7神经元细胞没有被抑制,因此选择31.25,62.5,125μg/m L剂量进行后续实验。对TBTC诱导后GT1-7神经元细胞活力的影响:与Con组相比较,TBTC造模能够显著抑制GT1-7神经元细胞活力（P＜0.01）,17β-E2组和调更汤低、中、高剂量组损伤的GT1-7细胞活力显著增强（P＜0.01）。2)对TBTC诱导后GT1-7神经元细胞形态的影响:Con组GT1-7细胞生长良好,形态规则,树枝状突触明显,细胞透亮;与Con组比较,TBTC组GT1-7细胞贴壁细胞数目减少,细胞体积缩小,连接消失,与周围细胞脱离,形态固缩呈亮圆点状,突触缩短或消失;与TBTC组比较,17β-E2组细胞形态多数正常,固缩亮圆点细胞显著减少,调更汤低、中、高剂量组固缩亮圆点细胞显著减少。3)对TBTC诱导后GT1-7神经元细胞核的影响:Hoechst33258染色实验结果表明,与Con组相比较,TBTC组细胞固缩、碎裂、染色增强,呈高亮蓝色细胞核显著增多（P＜0.01）;与TBTC组比较,17β-E2组和调更汤高剂量组细胞固缩、碎裂、高亮蓝色的细胞核显著减少（P＜0.01）。4)对TBTC诱导后GT1-7神经元细胞凋亡率的影响:Annexin V-FITC/PI双染色法结果表明,与Con组比较,TBTC组GT1-7神经元细胞凋亡比率显著增加（P＜0.01）;与TBTC组比较,17β-E2组和调更汤低、中、高剂量组GT1-7神经元细胞凋亡率显著减少（P＜0.01）。5)TMT磷酸化修饰定量蛋白组学生信分析:KEGG通路聚类分析发现,与Con组相比,TBTC干预GT1-7神经元细胞后,MAPK通路被显著富集。蛋白磷酸化修饰位点差异蛋白发现,与Con组相比较,TBTC干预GT1-7神经元细胞后,ASK1、MKK7、AP-1磷酸化水平显著升高;与TBTC组相比较,TG干预GT1-7神经元细胞后,MKK7磷酸化水平显著降低。6)q RT-PCR实验结果:TBTC处理导致Bax m RNA水平升高和Bcl-2 m RNA水平降低,与Con组相比较,Bcl-2/Bax的比值为0.42（P＜0.01）。与TBTC组相比较,调更汤低、中、高剂量组和17β-E2组Bcl-2/Bax m RNA水平比值显著升高（P＜0.01）。7)Western blot实验结果:与Con组相比较,TBTC组p-ASK1,p-MKK7,p-JNK,p-c-Jun,CL-Casp3蛋白表达显著增加（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）。与TBTC组相比较,17β-E2组p-MKK7,p-JNK,p-c-Jun,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）,p-ASK1蛋白表达呈下降趋势（P＞0.05）;调更汤低剂量组p-MKK7,p-JNK,p-c-Jun,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）;调更汤中剂量组及调更汤高剂量组p-ASK1,p-MKK7,p-JNK,p-c-Jun,CL-Casp3蛋白表达均显著降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。TBTC处理导致Bax蛋白水平显著升高和Bcl-2蛋白水平降低,与Con组相比较,TBTC组Bcl-2/Bax的比值显著降低（P＜0.01）;与TBTC组相比较,调更汤低、中、高剂量组和17β-E2组Bcl-2/Bax比值显著升高（P＜0.01）。在JNK抑制剂SP600125实验中,与Con组相比较,TBTC组p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著增加（P＜0.01）。与TBTC组比较,TBTC联合SP600125组p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01,P＜0.05）;17β-E2组p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.05）;调更汤高剂量组p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.05,P＜0.01）;调更汤高剂量组联合SP600125组p-JNK,CL-Casp3蛋白表达显著降低（P＜0.01）。结论1.动物实验证实调更汤对去势5月龄SD大鼠下丘脑神经细胞具有保护作用,其作用机制可能是通过抑制ASK1/MKK7/JNK信号通路改善神经细胞凋亡起到神经保护的作用;2.细胞实验进一步证实调更汤对下丘脑神经元细胞具有神经保护作用,其作用机制可能是通过抑制ASK1/MKK7/JNK信号通路改善GT1-7神经元细胞凋亡起到神经保护的作用。