【摘 要】
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目的:骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨量降低,骨组织微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身代谢骨病。增龄相关的骨骼肌质量和力量下降,一方面通过限制活动能力,提高跌倒和骨折的风险。另一方通过机械作用、内分泌、旁分泌等方式加速骨质流失,增加骨折风险。老年人群易发骨质疏松骨折,严重影响生活质量,进一步可威胁生命。目前对增龄相关的肌萎缩及进展发生的骨骼肌减少症对骨代谢的影
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目的:骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨量降低,骨组织微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身代谢骨病。增龄相关的骨骼肌质量和力量下降,一方面通过限制活动能力,提高跌倒和骨折的风险。另一方通过机械作用、内分泌、旁分泌等方式加速骨质流失,增加骨折风险。老年人群易发骨质疏松骨折,严重影响生活质量,进一步可威胁生命。目前对增龄相关的肌萎缩及进展发生的骨骼肌减少症对骨代谢的影响的尚未清楚,仍需进一步研究。增龄引起的脂肪浸润可加快肌力下降,骨骼肌横截面减少和骨量减少的速度,其中胆固醇的作用不容忽视。胆固醇以低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）形式被低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR）识别并向细胞内转运,参与细胞代谢。这一过程对骨骼肌—骨骼的作用尚未明晰,值得进一步研究。课题组前期成果显示,LDLR低表达有助于改善老年小鼠的骨骼肌质量和力量。因此我们推测,敲低老年小鼠骨骼肌LDLR表达可能会一定程度上通过增强骨骼肌质量和力量改善老年小鼠骨量和骨髓微环境,具有防控OP作用。pAAV-Cas9系统具有免疫原性低,安全性高,能长时间稳定表达等优势。本课题组前期利用pAAV-Cas9系统构建靶向骨骼肌的敲低LDLR的AAV载体。我们通过pAAV-Cas9系统靶向敲低骨骼肌LDLR表达,提高骨骼肌质量和功能,实现老年小鼠骨量的改善。进而探讨LDLR低表达对骨骼肌、骨骺、骨髓脂肪及骨量的可能影响,为骨质疏松症的防治提供一定的实验依据。方法:老年小鼠随机分为3组,并设青年小鼠组作为老年组对照。构建的载体包括:携带骨骼肌特异性启动子MCK的pAAV-tMCK-Cas9载体,携带小鼠LDLR向导RNA的AAV-U6gRNA-U6gRNA质粒和空载体AAV-U6-U6。老年小鼠实验组:通过尾静脉注射方式将pAAV-tMCK-Cas9载体和AAV-U6gRNA-U6gRNA载体导入老年小鼠;老年小鼠空载体组:将pAAV-tMCK-Cas9载体和AAV-U6-U6载体导入老年小鼠空载体组;老年小鼠组和青年小鼠组注射生理盐水作为对照。注射后在SPF环境饲养8周,之后进行四肢抓力测试,处死取材。通过HE染色观察肌纤维的改变,通过qPCR检测骨骼肌组织LDLR、骨骼肌肌球蛋白重链亚型MYH1、MYH4的mRNA含量变化;通过Western Blotting方法检测LDLR蛋白水平;骨组织样本通过HE染色及Goldner染色分析骨骺、骨髓脂肪改变等;通过micro-CT检测评估小梁骨和皮质骨的骨量、骨矿物质密度等;使用IBM SPSS Statistic 26对数据进行统计分析。结果:（1）与青年小鼠组相比,老年小鼠组四肢抓力下降12.15%（P=0.03）;HE染色结果显示,腓肠肌肌纤维间隙较宽,肌纤维排列结构松散,肌纤维横截面细胞核较少;MYH1和MYH4的mRNA水平也下降。提示老年小鼠的骨骼肌力量和质量下降。（2）敲低骨骼肌LDLR后,老年小鼠实验组的LDLR mRNA水平显著低于老年小鼠空载体组（P＜0.01）,LDLR的mRNA相对表达水平仅为老年小鼠空载体组的24.72%,而LDLR的蛋白相对水平是老年小鼠空载体组的38.75%（P＜0.01）。证实老年小鼠实验组骨骼肌LDLR敲低模型构建成功。与老年小鼠空载体组相比较,老年小鼠实验组四肢抓力增强了 12.02%（P＜0.01）;肌纤维排列紧实,间隙缩窄,肌纤维横截面细胞核数量增多;骨骼肌MYH1和MYH4的mRNA分别升高140%和133%。这些结果表明骨骼肌LDLR敲低后老年小鼠骨骼肌力量和质量得到提升。（3）与青年小鼠组相比,HE、Goldner染色结果显示老年小鼠组出现骨骺明显变薄、小梁骨稀疏、骨髓腔脂肪浸润;micro-CT三维重建及数据分析显示,老年小鼠实验组的实验组胫骨骨小梁厚度、骨向异性程度及骨矿物质密度降低;皮质骨的骨体积分数、骨表面积骨体积比和骨矿物质密度明显下降、骨矿物质密度降低。（4）敲低老年小鼠骨骼肌LDLR后,老年小鼠实验组骨骺内软骨细胞有恢复细胞柱形的趋势,扁平的增殖期细胞增多,提示骨骺正在变厚;骨髓脂肪明显减少。micro-CT及数据分析显示老年小鼠实验组胫骨骨小梁厚度、骨向异性程度及骨矿物质密度有一定增加;皮质骨的骨表面积密度、骨表面积骨体积比和骨矿物质密度也有一定增加。结论:（1）本研究发现骨骼肌LDLR敲低后老年小鼠骨骼肌力量和质量得到的提高,同时胫骨骨骺内软骨细胞数量增加、骨髓脂肪减少、骨量有改善。（2）本研究通过分析敲低老年小鼠骨骼肌LDLR对骨骼肌、骨骺、骨髓脂肪及骨量的改变,对加深LDLR相关的脂代谢与骨骼肌、骨髓脂肪和骨骼三者关系的认识起到一定促进作用。
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