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目的:B类GPCR(G protein coupled receptor,GPCR)PAC1-R是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)的偏好受体,其介导有效的神经保护活性。PAC1-R具有一个相对较大并且结构复杂的N-端胞外结构域(PAC1-EC1),负责识别和结合配体。我们已有的研究显示具有显著体内外神经保护作用的强力霉素(Doxycycline,DOX)和米诺环素(Minocycline,MINO)可以作为PAC1-R的正向别构调节剂(Positive allosteric modulator,PAM)通过结合PAC1-EC1促进PAC1-R的正位激活(Yu R*,et al.Neuropharmacology.2015;103:1-15.)。基于以上研究基础,本研究拟通过计算机分子对接、微量热电泳(Microscale Thermophoresis,MST)、定点突变和cAMP检测等技术,分析和比较DOX/MINO及其衍生物,包括DOX不同修饰物、四环素(Tetracycline,TET)和替加环素(Tigecycline,TIGE)对PAC1-R的别构调节作用,试图详尽PAC1-R的N-端胞外结构域中正向别构调节剂结合位点的细节,为后续靶向PAC1-R的新型别构调节剂的筛选奠定基础。方法:利用Discovery Studio 2.5 Libdock获得DOX/MINO/TET/TIGE与PAC1-EC1的分子对接3D模型,并分析比较它们结合位点的信息;随后从分子水平利用MST分析技术测定DOX/MINO及其衍生物与PAC1-EC1结合的亲和力(平衡解离常数KD,解离百分比DP);利用已建立的人为高表达PAC1-R偶联增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescence Protein,eGFP)的PAC1-CHO细胞系结合cAMP检测和MTT检测,从细胞水平检测DOX/MINO及其衍生物对PAC1-R正位激动剂PACAP(1-13)正位激活的别构调节作用;运用蛋白别构位点预测软件AlloSite对PAC1-R的N端胞外域进行别构调节位点预测;通过分析对比预测结果和分子对接结果中作用残基出现的频率,筛选出对PAM主要贡献的四个关键基序;最后通过定点突变获得与关键基序相应的PAC1-EC1四个突变体的重组蛋白,并结合MST检测实现对关键基序的鉴定。结果:MST结果发现三种不同化学修饰的DOX的KD值:C22H24N2O8.1/2C2H6O.HCL.1/2H2O(6940+/-274μM)>C22H24N2O8(203.0+/-25.2μM)>C22H24N2O8.H2O(148.0+/-4.28μM),表明复杂的化学修饰会干扰DOX与PAC1-EC1的结合,其中没有任何修饰的DOX(C22H24N2O8)(203.0+/-25.2μM)和MINO(C23H27N3O7.HCL)(289.0+/-15.4μM)具有相似的结合性,TIGE(C29H39N5O8)(610.0+/-23.8μM)的结合能力最差;cAMP和MTT检测表明,DOX/MINO显著提高PACAP(1-13)对PAC1-R的激活,其EC50值分别为11.2±1.7nM和7.1±1.1nM,是PAC1-R的高效PAMs,TET的EC50为44.3±2.4nM,是PAC1-R的低效PAMs,TIGE的EC50>1000nM,是PAC1-R的沉默别构调节剂;蛋白别构位点预测结果和分子对接结果筛选出构成小分子PAMs结合的四个关键基序;获得四个关键基序相对应的重组突变体,分别是:rPEM1:I26F27--A26A27,rPEM2:N60I61--A60A61,rPEM3:F110D111--A110A111,rPEM4:F115D116--A115A116;MST分析发现基序N60I61的突变完全干扰了小分子PAMs与PAC1-EC1的结合,是PAMs的关键组成;而基序F115D116一方面抑制了DOX的结合,另一方面促进了MINO的结合,表明基序F115D116在小分子PAMs与PAC1-EC1的结合中扮演复杂的边缘角色。结论:本研究首次在实验水平鉴定了DOX/MINO及其衍生物与PAC1-EC1的结合并具体测定亲和力;检测了DOX/MINO及其衍生物靶向PAC1-R的别构调节作用;验证了生物信息学预测的位于PAC1-R的N端胞外域中别构调节位点的存在;详尽了构成PAC1-R的N端胞外域的正向别构调节位点关键氨基酸的信息,为后续靶向PAC1-R的新型别构调节剂的筛选奠定基础。