【摘 要】
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鸭圆环病毒（Duck Circovirus,DuCV）是一单链环状DNA病毒,DuCV首次在德国发现,2005年在我国境内检测出鸭群中感染DuCV。DuCV可破坏鸭的免疫系统,引起鸭的免疫抑制,导致机体免疫力降低,从而引发其他病原菌的继发感染,使二重以及多重感染的几率增加或者加重其他疾病,造成鸭群的死亡。近年来鸭群中DuCV的感染率呈上升趋势,对规模化养殖场的危害越来越严重,因此DuCV成为了危害
【基金项目】
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中央引导地方科技发展资金项目（YDZX20203700004857）；
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鸭圆环病毒（Duck Circovirus,DuCV）是一单链环状DNA病毒,DuCV首次在德国发现,2005年在我国境内检测出鸭群中感染DuCV。DuCV可破坏鸭的免疫系统,引起鸭的免疫抑制,导致机体免疫力降低,从而引发其他病原菌的继发感染,使二重以及多重感染的几率增加或者加重其他疾病,造成鸭群的死亡。近年来鸭群中DuCV的感染率呈上升趋势,对规模化养殖场的危害越来越严重,因此DuCV成为了危害养鸭场的重要病毒之一,而目前仍然缺乏一种快速有效的针对DuCV的检测方法。胶体金免疫层析试纸方法具有检测速度快、特异性强、方法简单等优点,非常适合于基层使用的快速检测方法。Cap蛋白是DuCV的主要结构蛋白,具有很好的免疫原性和反应原性,也是研究DuCV的重要蛋白。因此,本研究以Cap蛋白为研究对象,制备单克隆抗体,研发快速检测DuCV的胶体金免疫试纸条,实现DuCV的快速诊断与防治。本研究中去除DuCV Cap的N端核定位序列（Nuclear localization signals,NLS）,即去除Cap基因的5′端1-108 bp区域,保留剩余的109-774 bp区域,N端引入His标签,以便于抗原的纯化,最后将核酸序列克隆到大肠杆菌表达质粒p ET-28a中,质粒命名为p ET-28a-Cap,并转化到大肠杆菌BL21菌株中使Cap蛋白能够高效的表达。最终得以确定其最佳诱导表达条件为在终浓度0.1 m M IPTG诱导剂中37℃诱导3 h,重组Cap蛋白主要以包涵体形式得到表达。使用弗氏佐剂制备的重组DuCV Cap蛋白免疫2只Balb/c雌性小鼠,ELISA检测2只小鼠的血清抗体效价均在1:20480,满足细胞融合的要求,分离提取免疫小鼠脾脏细胞和sp2/0细胞进行细胞融合,ELISA方法筛选能够分泌抗DuCV Cap蛋白的特异性抗体的阳性孔并进行亚克隆,最终获得了能够稳定分泌抗DuCV Cap蛋白的一株杂交瘤细胞株6A1。Western bolt结果显示,6A1株单克隆抗体可以和重组DuCV Cap蛋白以及天然DuCV Cap蛋白能发生特异性的结合。对单抗6A1的Ig G类型鉴定结果表明6A1的Ig G类型为Ig G1亚类和Kappa轻链。将6A1杂交瘤细胞株注射到雌性Balb/c小鼠的腹腔用以大量制备单克隆抗体,间接ELISA检测结果表明注射杂交瘤细胞株小鼠腹水的抗体效价可达1:102400。同时,用弗氏佐剂制备的重组DuCV Cap蛋白疫苗对2只健康新西兰兔进行免疫,制备抗DuCV Cap蛋白多克隆抗体,经3次免疫7天后使用间接ELISA方法检测兔血清的抗体效价,结果显示两只兔血清的抗体效价均达到了1:163840,经Western blot鉴定,该兔多抗对重组DuCV Cap蛋白以及天然DuCV Cap蛋白均能发生特异性的结合。经过Protein A+G对小鼠腹水和兔血清进行抗体纯化,获得了高纯度的鼠抗DuCV Cap蛋白的单克隆抗体和兔抗多克隆抗体。进而以纯化的兔抗DuCV Cap蛋白多克隆抗体作为T线（2 mg/m L）,纯化的鼠6A1单克隆抗体（64μg/m L,p H 8.0）作为胶体金标记抗体,以羊抗鼠Ig G（1 mg/m L）作为C线,组装胶体金检测试纸条。该DuCV抗原胶体金免疫层析试纸条在检测MDPV、GPV、DPV、NDV、AIV、DHV、FAd V和DRV中均不发生交叉反应,试纸条特异性良好,检测抗原的敏感度可达15.6μg/m L。在39份的疑似感染鸭样品的检测中,分别用本次研究制备的胶体金试纸条与传统的PCR两种方法进行检测,检测结果符合率可达94.9%,检测结果准确度较高,同时经多次测试都表明试纸条有较好的重复性和稳定性,能够在10 min内完成对样品的快速检测。总之,本次研究制备的基于DuCV Cap蛋白单克隆抗体的胶体金抗原检测试纸条可以实现快速、特异地检测临床样本中的DuCV,可用于DuCV的基层诊断和筛查工作。
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