HIV病毒自从被发现以来,已成为了全球公共健康的一大威胁,对其治疗策略的研究也在不断进行。由于潜伏病毒库的存在,联合抗逆转录病毒疗法无法清除患者体内潜伏的前病毒,一旦停药,病毒将容易发生反弹。为了摆脱HIV患者的无限期治疗,借助基因治疗的平台,构建HIV抗性细胞被证明具有一定可行性,但表达HIV抗性基因的修饰细胞回输患者体内后的占比较低,表现出的抗病毒效果有限。因此,具有广谱且强效的抗病毒能力,并能给所有细胞广泛提供保护作用的基因治疗策略亟待研究。根据本实验室多肽研究基础我们认为脂质修饰的多肽通过脂类与细胞膜的黏附等作用,有效地提高了多肽的抗病毒活性。此外,在本组前期研究中证明,通过跨膜结构域将多肽锚定在HIV靶细胞膜上,经此修饰的细胞对不同亚型及嗜性的毒株感染均具有完全抵抗的能力。基于这些研究基础,在本研究中我们首先将靶向病毒颗粒gp41融合蛋白的多肽与靶向宿主细胞膜表面受体分子的抗体单链可变区融合表达,构建重组双功能抑制剂。由于组成双功能分子的两功能部分作用于不同位点,我们设计了 G4S重复序列组成的柔性linker将两者相连,并构建了不同长度的linker以确保不影响两功能部分与靶点的结合,能充分发挥双功能分子的抗病毒作用。在此策略下不仅可将膜融合抑制剂锚定于膜上发挥更强的抗病毒效果,同时也增加了抗病毒的作用位点,使HIV难以对其产生耐药。最终通过慢病毒载体将双功能进入抑制剂基因整合入靶细胞,使其持续分泌抗病毒分子,保护修饰细胞自身以及周围未修饰细胞免受病毒感染。通过单轮感染实验我们证明了重组双功能抑制剂的IC50平均值可达ng/mL,相较于单独的多肽或者抗体单链可变区,其活性明显提高十几倍至上百倍,表明了该重组蛋白能有效发挥双功能作用,具有强效且广谱的抗病毒活性。并且重组蛋白的抗病毒实验结果同时表明了靶向宿主的抗体单链可变区与多肽P41之间的linker长度对本研究中设计的双功能分子活性影响不明显。通过自我失活型慢病毒载体,编码重组双功能抑制剂的基因被成功整合入HIV靶细胞中,抗病毒分子通过靶细胞合成并分泌至细胞培养上清中,双功能抑制剂与宿主受体或辅助受体结合将自身锚定于细胞膜上,提高了病毒进入细胞位点附近抗病毒分子的局部浓度。抗病毒实验证明分泌抗病毒分子的基因修饰细胞具有广泛抵抗不同亚型毒株感染的能力,并且在阻止HIV病毒包膜蛋白介导的细胞膜融合和细胞相关病毒细胞间传播的过程中也能表现出不同程度的抑制作用。其中对于病毒的细胞间传播,靶向CCR5的重组双功能抑制剂修饰细胞表现出更强的抑制作用,几乎能完全抵抗病毒通过细胞间接触进行传播。在CD4+T细胞系中我们进一步证明了基因修饰细胞的抗病毒能力。P41-iMab或 2P23-PRO140、P41-PRO140、m36.4-PRO140 修饰的 CEMss/CCR5 细胞均能完全抵抗R5型以及X4型HIV-1毒株的感染。在含有一定比例基因修饰细胞的混合体系中,基因修饰细胞分泌的抗病毒分子对未修饰细胞也表现出不同程度的保护作用,其中分泌靶向CCR5辅助受体的双功能抑制剂基因修饰细胞对未修饰细胞的保护作用更强于分泌靶向CD4受体的双功能抑制剂基因修饰细胞。在混合体系中基因修饰细胞比例足够高时,能保护体系中所有细胞免受感染。在病毒攻击后,含有修饰细胞的混合体系中的病毒载量明显下降,m36.4-PRO140作用下病毒载量下降尤为明显,可降低至检测线以下。其余修饰细胞在混合体系中表现出的抗病毒活性相对m36.4-PRO140有所减弱,不能完全保护未修饰细胞,但同样能降低混合体系中病毒载量。并且随着混合体系中修饰细胞比例的增加,对未修饰细胞的保护能力也随之增加。综合以上研究结果我们提出,通过基因治疗方法修饰HIV靶细胞,使其持续分泌靶向宿主CD4受体或CCR5辅助受体的强效双功能分子的治疗策略可行且具有应用潜力。