斑马鱼骨骼肌损伤修复的转录组分析和sdc4初步功能研究

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骨骼肌是动物体内受到一定程度损伤后可再生的组织,而肌肉卫星细胞在肌肉的生长发育与损伤修复过程中都扮演着不可或缺的角色。骨骼肌的损伤修复是一个复杂且高效的级联过程,环环相扣。本研究以模式生物斑马鱼为对象,基于斑马鱼肌肉损伤模型,通过转录组测序等方法分析并筛选出在骨骼肌修复再生中具有重要作用的基因,以了解鱼类肌肉损伤修复的分子调控机制,并对多配体蛋白聚糖4(Syndecan-4,sdc4)进行初步功能分析。主要研究结果如下:(1)利用心肌毒素构建斑马鱼肌肉损伤修复模型,并基于转录组与lnc RNA测序筛选差异表达基因。转录组分析结果显示斑马鱼肌肉损伤后差异表达基因2007个,其中上调表达的有1115个,下调表达的有892个。GO富集分析中差异表达基因显著富集于细胞再生、蛋白的结合、信号转导以及酶活性等过程;KEGG分析发现,脂肪酸代谢与细胞骨架的重塑是修复过程中最为活跃的部分。进一步分析发现与肌纤维发育(myog、tnnc2、myo19等)及细胞骨架重塑(如tiam1、sdc4、tuba等)等通路中的相关基因在骨骼肌损伤后的修复过程中可能发挥重要功能。(2)差异表达的lnc RNA共有901个,已被鉴定出靶向基因的有103个,其中50个上调表达,53个下调表达。将差异最显著的前二十个lnc RNAs的靶基因进行通路富集分析,发现参与调控肌纤维发育过程的靶基因如foxo1a、tns1b等,以及与肌纤维损伤修复和细胞骨架重塑相关的靶基因pnck、mical3a、nfixa等显著富集,说明肌肉受损后,lnc RNAs可通过调控靶基因参与损伤的修复。(3)运用CRISPR/Cas9技术构建卫星细胞主要表面标记基因sdc4的敲除突变体,获得了缺失8个和10个碱基的两种突变类型。通过体长体重测量发现,敲除体较野生型体长更短,体型更小,表明敲除sdc4对斑马鱼的生长发育会造成一定影响。另外,基于生物信息学分析发现,sdc4基因的3’UTR区存在dre-mi R-141的结合位点,通过荧光素酶报告系统检测,显示dre-mi R-141可以与sdc4 3’UTR结合并调控其转录。
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