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缺血诱发的细胞应激性衰老是影响心血管疾病发生发展的潜在靶点。有研究发现,心肌缺血诱发的心肌细胞衰老是心功能不全的主要原因。成纤维细胞是缺血性损伤后组织修复的重要参与者,模拟急性心肌梗死的氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)可诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,通过分泌胶原等介导组织修复,促进损伤部位瘢痕的形成。研究发现,成纤维细胞的衰老影响缺血组织损伤修复。衰老的成纤维细胞一方面通过分泌细胞因子放大级联炎症反应,加剧组织损伤;另一方面通过保持自身激活状态,导致胶原的沉积,加重纤维化,最终损伤组织功能。因此,明确缺血诱导的成纤维细胞衰老机制可为临床治疗衰老相关缺血性疾病提供有效的理论基础,具有重要的临床意义。近年研究表明,缺血可诱导成纤维细胞特异性高表达白介素11(Interleukin11,IL11),而IL11可通过激活JAK2/STAT3通路诱导成纤维细胞胶原的分泌与沉积,参与纤维化过程。研究发现,衰老成纤维细胞中IL11是衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的重要成分之一,可通过促进成纤维细胞胶原沉积,发挥促纤维化作用。由此推测IL11可能参与缺血诱导的成纤维细胞应激性衰老,但其对缺血诱导应激性衰老的影响及机制尚未明确。犬尿氨酸(kynurenine,KYN)代谢通路活性改变与衰老等疾病有关,干预此通路能延长果蝇和线虫的寿命。吲哚胺2,3-双加氧化酶(indoleamine 2,3dioxygenase 1,IDO1)是KYN代谢途径的关键限速酶。研究发现,缺氧条件下成纤维细胞中IDO1表达下调,其介导产生的KYN可发挥抗衰老和抗纤维化作用,提示IDO1参与成纤维细胞的衰老过程。有研究报道IDO1可经JAK2/STAT3降解。然而目前关于IL11对成纤维细胞中KYN代谢的影响尚未阐明。综上,本研究推测缺血诱导的成纤维细胞应激性衰老中,IL11可能通过IDO1介导的KYN分泌影响缺血诱导的成纤维细胞衰老进程。研究目的:明确IL11对体外OGD条件诱导NIH3T3和L929成纤维细胞应激性衰老的影响;探究IL11对OGD诱导NIH3T3和L929成纤维细胞应激性衰老模型中KYN的影响;进一步阐明IL11调控OGD诱导NIH3T3和L929成纤维细胞应激性衰老模型中KYN的机制。实验方法:1.构建OGD诱导NIH3T3和L929细胞的应激性衰老模型以小鼠胚胎来源NIH3T3成纤维细胞和真皮来源的L929成纤维细胞为实验对象,使用无糖无血清培养基,1%O2,94%N2和5%CO2为培养环境,作为OGD条件,应用MTT法检测OGD处理2h、4 h、6 h、8 h和10 h NIH3T3和L929细胞的存活率;采用Western blot方法检测衰老标志物p53、p21和p16的蛋白表达;根据以上实验结果明确OGD对NIH3T3和L929细胞应激性衰老的影响,并确定OGD诱导细胞应激性衰老模型的最适时间。采用RT-q PCR方法检测OGD不同时长处理的NIH3T3和L929细胞collagen I、collagen III m RNA表达;采用Western blot方法检测collagen I、collagen III、α-SMA和TGFβ蛋白表达。明确应激性衰老成纤维细胞中胶原表达的变化情况。2.明确IL11对OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老及胶原表达的影响采用RT-q PCR和Western blot方法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中IL11的表达;通过瞬时转染si RNA抑制成纤维细胞中IL11表达,采用RT-q PCR和Western blot方法,检测抑制IL11后OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中衰老标志物及胶原蛋白collagen I、collagen III表达的变化;采用胶原收缩实验,检测抑制IL11后OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中胶原的变化;通过补充重组鼠IL11,采用RT-q PCR和Western blot方法,检测补充IL11对OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中衰老标志物及胶原表达的变化;采用胶原收缩实验,检测补充IL11后OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中胶原的变化。3.探究IL11对OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中KYN的影响采用Ehrlich法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中犬尿氨酸代谢产物KYN水平变化;补充犬尿氨酸代谢产物L-KYN后,采用Western blot方法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中胶原表达;抑制或补充IL11后,采用Ehrlich法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中KYN水平变化;同时补充犬尿氨酸代谢产物L-KYN和IL11后,采用Western blot方法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中胶原表达变化;抑制或补充IL11后,采用RT-q PCR、Western blot、免疫荧光方法和ELISA试剂盒,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中IDO1的表达变化。4.探讨IL11调控OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中IDO1的机制抑制或补充IL11后,采用Western blot方法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3和IDO1蛋白的表达变化;给予JAK2/STAT3抑制剂AG490和重组鼠IL11细胞因子,采用Western blot方法,检测OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3和IDO1蛋白的表达变化。实验结果:1.OGD诱导成纤维细胞应激性衰老模型的建立(1)OGD分别处理2 h、4 h、6 h、8 h和10 h后,NIH3T3和L929细胞存活率在OGD处理4 h、6 h、8 h和10 h时显著下降;(2)NIH3T3和L929细胞中衰老标志蛋白p53、p21和p16表达在OGD处理4 h、6 h、8 h和10 h时显著增加;因此,结合细胞存活率结果选择OGD处理6 h为OGD诱导NIH3T3细胞和L929细胞应激性衰老模型的最适时间;(3)OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中,胶原相关蛋白collagen I、collagen III、TGFβ和肌成纤维细胞标志物α-SMA表达升高;且collagen I、collagen III的m RNA和蛋白表达在OGD处理6 h、8 h和10 h时显著增加;以上结果表明,OGD诱导成纤维细胞应激性衰老,且增加应激性衰老成纤维细胞的胶原表达。2.IL11对成纤维细胞应激性衰老及胶原表达的影响(1)OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中,IL11的m RNA和蛋白表达水平显著升高;(2)抑制IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中衰老标志蛋白p53、p21和p16的表达降低,胶原蛋白collagen I、collagen III的表达显著降低且胶原收缩减弱;(3)补充IL11后,OGD诱导NIH3T3细胞和L929细胞衰老模型中衰老标志蛋白p53、p21和p16表达显著增加,胶原蛋白collagen I、collagen III表达增加,胶原收缩增强。以上结果表明,IL11促进成纤维细胞应激性衰老及胶原表达。3.IL11对应激性衰老成纤维细胞中犬尿氨酸的影响(1)OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中细胞上清液KYN水平降低;补充L-KYN后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中胶原蛋白表达降低;(2)抑制IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中细胞上清液KYN水平增加;补充IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中细胞上清液KYN水平降低;同时补充IL11和L-KYN后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中胶原蛋白表达降低;(3)OGD诱导NIH3T3和L929细胞应激性衰老模型中IDO1表达降低;抑制IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中IDO1的蛋白表达增加;补充IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中IDO1表达降低。以上结果提示,IL11可能通过抑制IDO1表达减少KYN的产生,促进应激性衰老成纤维细胞的胶原表达。4.IL11影响应激性衰老成纤维细胞中IDO1表达的机制(1)抑制IL11后,OGD诱导NIH3T3细胞衰老模型中p-JAK2、p-STAT3、SOCS3和p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著降低;L929细胞衰老模型中p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白表达明显下调,但p-Akt、p-m TOR蛋白表达变化不明显;(2)补充IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中p-JAK2、p-STAT3、SOCS3和p-Akt、p-m TOR蛋白表达增加;抑制JAK2/STAT3通路并补充IL11后,OGD诱导NIH3T3和L929细胞衰老模型中p-JAK2、p-STAT3、SOCS3表达降低,IDO1表达升高。以上结果表明,IL11可通过JAK2/STAT3/SOCS3抑制IDO1表达。实验结论:1.IL11可促进OGD诱导的应激性衰老NIH3T3和L929细胞中胶原表达;2.IL11可能通过调控IDO1/KYN代谢途径,促进成纤维细胞KYN积累,参与成纤维细胞应激性衰老;3.在成纤维细胞应激性衰老模型中,IL11可通过JAK2/STAT3/SOCS3通路抑制IDO1表达,促进KYN介导的成纤维细胞应激性衰老。