论文部分内容阅读
1研究背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性炎症性关节疾病,以关节骨侵蚀和系统性骨丢失区别于其他风湿性疾病。据统计,RA患者合并症及并发症高达84.71%,其中骨代谢紊乱导致的骨骼系统疾病占至36.94%,给家庭及社会带来沉重的经济负担。破骨细胞（Osteoclast,OC）和成骨细胞（Osteoblast,OB）偶联介导的骨稳态在RA骨代谢异常中扮演关键角色。生理状态下,OC与OB相互作用维持骨稳态,但在RA病理状态下,OC介导的骨吸收亢进和OB介导的骨生成不足导致骨代谢紊乱。因此,通过调节OC与OB的分化和功能,恢复骨稳态平衡是治疗RA骨骼系统受累的重要切入点。在中医基础理论中,RA属中医学“痹证”范畴,“肾虚”被认为是RA骨代谢异常的主要病因病机,其通过影响OB与OC之间的稳态,导致骨重塑异常。二至丸（Erzhi Pill,EZP）最早记载于明代《扶寿经方》,由女贞子、墨旱莲两味中药组成,具有滋阴补肾的功效。现代药理学研究发现,EZP活性成分特女贞苷和蟛蜞菊内酯分别促进OB生成和抑制OC分化。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）作为治疗RA的临床一线用药,对RA骨稳态发挥着有限调节作用,但临床疗效存在个体差异。因此,本研究通过EZP与MTX联合用药增加药物效用,最大化发挥对RA的治疗作用。课题组前期研究发现,EZP 联合 MTX（Erzhi Pill combined with Methotrexate,EZP+MTX）发挥对胶原诱导性关节炎（Collagen-inducedarthritis,CIA）大鼠OB具有调节作用,但对OC作用尚不清楚。推测为证型（非肾虚）与治法（补肾法）不匹配,导致EZP未能同时通过OC-OB充分发挥其双重调节骨稳态药效。芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AHR）是一种配体依赖转录因子,可广泛地被环境、饮食、共生微生物和代谢产物激活。课题组前期综述发现,AHR在骨代谢中发挥调节作用,并且课题组前期实验研究发现MTX通过AHR介导肠道菌群与肠黏膜免疫互作,减轻CIA大鼠疾病进程。但EZP+MTX对肾虚痹证（RA）骨稳态发挥优势调控,其机制是否与AHR信号通路相关尚需进一步研究。鉴于此,本研究选择构建肾虚痹证（RA）大鼠模型,采用影像学、分子生物学等方法,进一步研究EZP+MTX对肾虚痹证大鼠骨代谢紊乱的调控作用,为骨稳态的机制探究提供新思路,为中西药结合治疗RA寻找新的分子靶标。2研究目的:阐明EZP+MTX对肾虚痹证大鼠骨稳态失衡的作用及机制,为研究EZP+MTX治疗肾虚痹证大鼠骨稳态失衡提供新依据。3实验方法:3.1二至丸水提物的制备和质控:EZP水提物制备:（酒）女贞子、墨旱莲药材各1kg,粉碎后加10倍体积的蒸馏水浸泡1h后回流提取两次,每次1 h,合并两次提取液,旋蒸浓缩得1:1水提物。EZP 质控:利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）对EZP水提物药物组分进行质量控制。3.2动物模型制备、分组及给药:肾虚痹证模型大鼠制备:选用6周龄SPF级180-200g雌性SD大鼠60只,随机选取50只进行卵巢切除术,剩余10只行假手术;4周后对卵巢切除术大鼠进行CIA造模,假手术组在造模部位注射生理盐水。加强免疫后,基于关节炎评分（ArthritisIndex,AI）剔除未成模大鼠,将剩余大鼠随机分为假手术组（Control组）、肾虚痹证模型组（Model组）、MTX组、EZP组、EZP+MTX组。根据分组进行灌胃给药:MTX组剂量为3mg/kg,2次/周;EZP组给予EZP水提物5.4g/kg,2次/日;EZP+MTX组灌服MTX、EZP的剂量分别与MTX组、EZP组相同;Control组与Model组分别于相同时间灌服等体积双蒸水。每3天进行AI评分,每周称重。持续给药6周后取材。3.3指标检测:（1）关节炎程度判断指标:对大鼠双下肢进行AI评分;取大鼠踝关节进行石蜡切片、H＆E染色;光镜下进行滑膜、软骨、骨、血管翳等关节病理损伤半定量分析。（2）骨密度指标检测:应用Micro-CT扫描大鼠股骨骨密度（Bonemineral density,BMD）以及第五腰椎BMD值;（3）骨生物力学指标检测:应用微机控制电子万能试验机检测各组大鼠左侧股骨的最大载荷、断裂强度以及弹性模量等生物力学参数;（4）OC、OB相关基因及蛋白检测:1)骨代谢指标:ELISA法检测大鼠血浆中骨吸收指标:Ⅰ型胶原羧基端肽（C-terminaltelopeptideoftype I collagen,CTX）、Ⅰ 型胶原氨基端肽（N-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen,NTX）、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP）;骨形成指标:Ⅰ型前胶原 N端肽（Procollagen I N-Terminal Propeptide,PINP）、Ⅰ型前胶原 C 端肽（Procollagen I C-Terminal Propeptide,PICP）。2)采用TRACP染色检测大鼠踝关节OC数量。3)采用qRT-PCR检测大鼠关节局部OC相关指标:核因子-kB受体（Receptor activator for nuclear factor-kB,RANK）、C-FOS 原癌基因蛋白（C-fos proto-oncogene protein,C-FOS）、活化 T 细胞因子（Nuclear factor of activated T-cellscytoplasmic,NFATC1）;OB 相关指标:核因子-kB 配体（Receptor activator for nuclear factor-kB ligand,RANKL）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）、骨钙素（Osteocalcin,BGP）、骨碱性磷酸酶（Bone alkaline phosphatase,BALP）。（5）IDO1-AHR信号轴活性检测:1)ELISA检测大鼠血浆中AHR通路相关指标:色氨酸（Tryptophan,TRP）、吲哚胺 2,3-二氧酶 1（Indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO1）、犬尿氨酸（Kynurenines,KYN）、犬尿喹啉酸（Kynurenicacid,KYNA）蛋白水平。2)qRT-PCR检测大鼠关节中IDO1-AHR信号轴中AHR、IDO1、色氨酸-2,3-双氧合酶（Tryptophan 2,3 dioxygenase,TDO2）mRNA 表达。3)免疫组化检测大鼠关节中AHR、IDO1蛋白表达。4实验结果:4.1高效液相色谱法对二至丸进行质量控制通过HPLC法将EZP水提物与女贞子、墨旱莲水提物对比,发现相同保留时间下,EZP水提物具有与女贞子、墨旱莲水提物类似的峰值信号。提示EZP水提物与女贞子、墨旱莲水提物主要成分相同,质量可靠,可进行后续实验。4.2二至丸联合甲氨蝶呤对肾虚痹证大鼠治疗作用各组大鼠经药物持续干预6周后,与Control组相比,Model组大鼠踝关节及以下部位发生严重肿胀,其AI评分、病理学评分显著上升（P＜0.01）;与Model组相比,MTX组、EZP组、EZP+MTX组大鼠踝关节及以下部位肿胀程度得到不同程度改善,MTX组和EZP+MTX组AI评分、病理学评分有统计学意义（P＜0.05;P＜0.01）;与MTX组比,EZP+MTX组大鼠AI评分、病理学评分显著下降（P＜0.05）;与EZP组比,EZP+MTX组大鼠AI评分、病理学评分显著下降（P＜0.05;P＜0.01）。4.3二至丸联合甲氨蝶呤对肾虚痹证大鼠骨稳态失衡的调节作用Micro-CT结果显示:与Control组比,Model组股骨BMD值、腰椎BMD值显著降低（P＜0.01）;与Model组比,EZP+MTX组股骨BMD值显著升高（P＜0.05）,EZP组、EZP+MTX组大鼠腰椎BMD值不同程度上升（P＜0.05;P＜0.01）;与单用药物组比,EZP+MTX组大鼠股骨BMD值和腰椎BMD值明显上升（P＜0.05）。骨生物力学结果显示:与Control组相比,Model组断裂强度和弹性模量显著下降（P＜0.05）;与Model组比,MTX组、EZP组、EZP+MTX组弹性模量均不同程度上升（P＜0.05;P＜0.01）,而断裂强度仅在EZP+MTX组呈上升趋势（P＜0.05）;与MTX组比,EZP+MTX组弹性模量显著上升（P＜0.01）。通过ELISA检测大鼠血浆中骨代谢相关指标,骨吸收指标结果显示:与Control组对比,Model组大鼠血浆中CTX、NTX、TRACP水平显著上升（P＜0.01）;与Model组相比,MTX组、EZP组、EZP+MTX组各组大鼠血浆中NTX、TRACP均不同程度下降（P＜0.05;P＜0.01）,MTX组、EZP+MTX组大鼠血浆中CTX均不同程度下降（P＜0.05;P＜0.01）;与MTX组相比,EZP+MTX组NTX、TRACP水平明显降低（P＜0.05）。骨形成指标结果显示:与Control组对比,Model组大鼠血浆中PINP、PICP水平显著下降（P＜0.01）;与Model组相比,MTX组、EZP组、EZP+MTX组各组大鼠血浆中PINP、PICP均不同程度上升（P＜0.05;P＜0.01）;与MTX组相比,EZP+MTX组PINP水平显著上升（P＜0.05）;与EZP组相比,EZP+MTX组PINP和PICP水平显著上升（P＜0.01）。TRACP染色结果显示:与Control组比,Model组OC数量显著上升（P＜0.01）;与Model组比,各组OC数量均不同程度减少（P＜0.01）;与MTX组比,EZP+MTX组OC数量显著下降（P＜0.05）;与EZP组比,EZP+MTX组OC数量显著下降（P＜0.01）。通过qRT-PCR检测大鼠关节中OC相关指标mRNA表达,结果显示:与Control组相比,Model 组RANK、C-FOS、NFATC1 mRNA 表达均升高（P＜0.05;P＜0.01）,与 Model组相比,MTX组、EZP组、EZP+MTX组RANK、C-FOS mRNA表达不同程度下降（P＜0.05;P＜0.01）,而NFATC1 mRNA 表达在 MTX 组、EZP+MTX 组呈下降趋势（P＜0.05;P＜0.01）;与 MTX 组比,EZP+MTX 组 C-FOS、NFATC1 mRNA 表达下降明显（P＜0.05;P＜0.01）,与EZP组比,EZP+MTX组NFA TC1mRNA表达下降明显（P＜0.01）。OB相关指标mRNA表达,结果显示:与Control组相比,Model组OPG、BGP、BALP mRNA表达均降低（P＜0.05;P＜0.01）,RANKL mRNA表达上升（P＜0.01）;与Model组相比,MTX 组、EZP 组、EZP+MTX 组 BGP、BALPmRNA 表达不同程度上升（P＜0.05;P＜0.01）,RANKL mRNA表达下降（P＜0.01）,MTX组、EZP+MTX组OPG mRNA表达不同程度上升（P＜0.05;P＜0.01）;与MTX组比,EZP+MTX组OPG、BGP、BALPmRNA表达显著上升（P＜0.05;P＜0.01）,RANKL mRNA表达统计学差异为P=0.05;与EZP组比,EZP+MTX组OPG、BGP、BALPmRNA表达显著上升（P＜0.05;P＜0.01）,RANKLmRNA表达统计学差异为P=0.05。4.4探讨IDO1-AHR信号轴在肾虚痹证大鼠骨稳态失衡的调节作用通过ELISA检测大鼠血浆中AHR通路相关指标,结果显示:与Control组相比,Model组大鼠血浆中KYN、KYNA蛋白水平明显下降（P＜0.05）;与Model组相比,MTX组、EZP组、EZP+MTX组KYN蛋白水平呈不同程度上升趋势（P＜0.05;P＜0.01）,而KYNA蛋白水平仅EZP+MTX组明显下降（P＜0.05）;与药物单用组比,EZP+MTX组KYN蛋白水明显上升（P＜0.05;P＜0.01）,而KYNA蛋白水平明显下降（P＜0.05）。通过qRT-PCR检测大鼠关节中AHR相关指标,结果显示:与Control组比,Model组的 AHR mRNA 表达下降（P＜0.01）;与 Model 组相比,MTX 组、EZP 组、EZP+MTX组AHR mRNA表达不同程度上升（P＜0.05）,MTX组、EZP+MTX组IDO1 mRNA表达不同程度上升（P＜0.01）;与MTX组比,EZP+MTX组AHR、IDO1 mRNA表达上升（P＜0.05;P=0.05）;与 EZP 组比,EZP+MTX组AHR、IDO1、TDO2 mRNA 表达上升（P＜0.05;P＜0.01）。通过免疫组化检测大鼠关节中AHR、IDO1蛋白表达。可见Control组AHR、IDO1指标少量阳性染色,与Control组比,Model组AHR、IDO1指标阳性染色减少;与Model组比,MTX、EZP、EZP+MTX组AHR、IDO1指标阳性染色不同程度增加,其MTX组、EZP+MTX组AHR、IDO1指标阳性染色增加明显。5结论:本研究实验结果表明,二至丸与甲氨蝶呤联合用药相比较单用二至丸或甲氨蝶呤,能明显改善肾虚痹证大鼠骨稳态失衡,最大化发挥对RA的治疗作用;EZP+MTX能显著降低肾虚证CIA大鼠骨吸收指标:CTX、NTX、TRACP蛋白水平及RANK、C-FOS、NFATC1mRNA表达,抑制OC活性;升高肾虚证CIA大鼠骨形成指标:PICP、PINP蛋白水平及OPG、BGP、BALP mRNA表达,促进OB活性,从而维持OC-OB相对稳态,防止骨量丢失;EZP+MTX可能通过调节IDO1-AHR信号轴中关键因子TRP、IDO1、KYN、KYNA、AHR发挥调节作用。