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磷脂酰胆碱(PC)是真核细胞必需的组分,主要分布在生物膜中,即是膜结构的主要组成成分,又参与细胞的多项生理活动,如脂蛋白的组装与运输等。而在原核细胞中,磷脂酰胆碱被发现主要分布在共生菌和致病菌中。已有的研究表明,PC在原核细胞与原核细胞之间相互作用、原核细胞侵染宿主细胞等过程中,可能起到重要作用。菌体分泌的效应因子主要是具有各种生物学活性的效应蛋白,不同的效应蛋白经由不同的分泌途径分泌到周质或膜外。根据分泌方式的不同,目前细菌的分泌系统被分为九大类：Ⅰ-Ⅷ分泌系统和伴侣监护(CU)分泌系统,其中属于Ⅴ型分泌系统(T5SS)分泌的效应蛋白在已探明的分泌蛋白中种类最多,分布最为广泛。Ⅵ分泌系统(T6SS)已被证实参与多种宿主细胞感染过程。假单胞菌属分为57个亚种,在自然界中广泛分布,已发现有多个亚种与动植物和人类的生命活动有密切关系,是多种动植物和人类疾病的病原菌。其中铜绿假单胞菌是最常见的机会致病菌之一,可引发多种动物创面感染,甚至败血症。因而探索铜绿假单胞菌与靶细胞之间的作用机理和影响因素具有重要的实际意义。本研究旨在探究在细胞膜上PC缺失条件下,铜绿假单胞菌T5SS和T6SS特异性分泌的效应蛋白的分泌量和生物学活性是否受到影响,为此作出以下工作并得出结论。(1)效应蛋白基因的克隆、蛋白表达及纯化。查询数据库数据,查明铜绿假单胞菌T5SS和T6SS特异性分泌蛋白分类和特性,从中选取V型分泌系统特异性分泌蛋白PlpD和EstA,VI分泌系统特异性分泌蛋白Tse1和Tse3。查询模式菌种铜绿假单胞菌PA01的plpD、estA、tse1、tse3基因序列,设计引物,从铜绿假单胞菌ATCC27853(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)中调取蛋白基因,连接克隆载体,基因测序并比对后证实为目的基因。利用生物学软件分析基因和所编码的蛋白序列。将目的基因连接表达载体,导入合适的表达菌株中,预表达并优化表达条件,成功表达目的蛋白。根据表达条件的不同制定相应地纯化方案,成功获得较纯的目的蛋白,测定蛋白浓度,计算纯化蛋白的量。当纯化蛋白的量足够时,采用适当的方法进行保藏。(2)多克隆抗体的制备。将纯化的蛋白抗原处理后,多次免疫注射新西兰大耳兔后,采用酶联免疫法(ELISA)检测兔子血清中多克隆抗体效价。符合标准后,取兔子血清作为多克隆抗体。利用得到的多克隆抗体,对野生型P. aeruginosa ATCC27853, PC缺失突变体菌株P. aeruginosa ATCC27853pcs的胞质蛋白、间质蛋白、胞外蛋白进行Western blotting检测,结果表明PC的缺失对V型分泌蛋白PlpD和EstA, VI分泌蛋白Tse1和Tse3的分泌均未见明显的影响。(3)效应蛋白酶活性比较。V型分泌蛋白PlpD和EstA均属于脂肪酶家族成员,可以催化分解相同的短链脂肪酸底物,但PlpD分泌到胞外培养基中,EstA附着在菌体外膜上。设计酶与底物反应体系,比较相对酶活,结果证实效应蛋白PlpD和EstA酶活性在野生型菌株P. aeruginosa ATCC27853和突变体菌株P. aeruginosa ATCC27853pcs-没有明显差异。Ⅵ分泌蛋白Tse1和Tse3属于溶菌酶蛋白,可以通过T6SS侵入到相邻异源菌株中,抑制或杀死异源菌株。设计抑菌试验,并对获得的实验数据做统计学分析,结果证实效应蛋白Tse1和Tse3酶活性在野生型菌株P. aeruginosa ATCC27853和突变体菌株P. aeruginosa ATCC27853pcs没有明显差异。初步的研究表明,细菌膜磷脂的PC组分存在与否对铜绿假单胞菌T5SS和T6SS效应因子的分泌未产生明显影响。