【摘 要】
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目的:本实验通过检测外源性重组小鼠IL-17A（Recombinant mice IL-17A,rmIL-17A）处理小鼠原代肺成纤维细胞后活化标志物及CXCL12的表达情况,并探究CXCL12/CXCR4及其下游信号通路表达情况,以期为肺纤维化的治疗提供新的靶点。方法:分离健康雄性BALB/c小鼠原代肺成纤维细胞,培养并稳定传代3次后根据细胞形态并应用免疫荧光技术进行鉴定,明确分离出的细胞为小鼠
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目的:本实验通过检测外源性重组小鼠IL-17A（Recombinant mice IL-17A,rmIL-17A）处理小鼠原代肺成纤维细胞后活化标志物及CXCL12的表达情况,并探究CXCL12/CXCR4及其下游信号通路表达情况,以期为肺纤维化的治疗提供新的靶点。方法:分离健康雄性BALB/c小鼠原代肺成纤维细胞,培养并稳定传代3次后根据细胞形态并应用免疫荧光技术进行鉴定,明确分离出的细胞为小鼠原代肺成纤维细胞;将小鼠原代肺成纤维细胞分为对照组和实验组,对照组不做处理,实验组分别加入浓度为50ng/m L、100ng/m L、200ng/m L的rmIL-17A刺激培养,24小时后采用Real-time PCR技术对两组成纤维细胞活化标志物I型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白及CXCL12 m RNA的表达水平进行检测;48小时后用蛋白印迹检测成纤维细胞活化标志物α-SMA、波形蛋白及下游信号通路ERK、JNK的表达情况,采用免疫荧光技术了解小鼠原代肺成纤维细胞细胞活化标志物I型胶原蛋白及CXCL12表达水平;48小时后收集对照组和实验组原代肺成纤维细胞培养上清液,采用ELISA分析上清液中CXCL12的表达水平。结果:1.在倒置相差显微镜下分离出的细胞呈多突的纺锤形或星形的长梭形扁平细胞,符合成纤维细胞形态特征,免疫荧光技术结果显示成纤维细胞表面标志物波形蛋白表达阳性;2.成纤维细胞活化标志物表达情况:在m RNA表达水平上,α-SMA表达水平仅在实验组浓度为100ng/m L时较对照组升高具有统计学意义（P＜0.05）,在实验组浓度为50ng/m L和100ng/m L时,I型胶原蛋白表达水平较对照组升高具有统计学意义（P＜0.05和P＜0.05）,波形蛋白表达水平在3组实验组中较对照组升高均具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01和P＜0.01）;在蛋白表达水平上,α-SMA蛋白表达水平在实验组浓度为100ng/m L和200ng/m L时较对照组升高具有统计学意义（P＜0.05和P＜0.01）,波形蛋白表达水平在3组实验组较对照组升高均具有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05和P＜0.001）,免疫荧光结果显示在实验组浓度为100ng/m L时,I型胶原蛋白表达水平较对照组升高;3.CXCL12表达水平:在m RNA水平上,实验组浓度为50ng/m L和100ng/m L时,CXCL12表达水平较对照组升高具有统计学意义（P＜0.01和P＜0.001）,免疫荧光结果显示在实验组浓度为100ng/m L时,CXCL12蛋白表达水平较对照组明显升高,在实验组浓度为50ng/m L和100ng/m L时,上清液中CXCL12表达水平高于对照组具有统计学意义（P＜0.05和P＜0.05）;4.CXCR4下游信号通路ERK1/2的磷酸化表达水平在3组实验组中表达均升高（P＜0.01、P＜0.001和P＜0.01）,JNK的磷酸化表达水平在实验组浓度为100ng/m L和200ng/m L中表达升高（P＜0.01和P＜0.01）,而AP-1信号通路在两组之间无明显差异性。结论:Rm IL-17A可促进小鼠原代肺成纤维细胞的活化并分化为肌成纤维细胞,促进肺成纤维细胞表达CXCL12。CXCL12与其特异性受体CXCR4结合后可能激活下游信号通路ERK1/2和JNK发挥生物活性作用,而在AP-1通路在此过程中未发现明显激活。因此,IL-17A/CXCL12/ERK1/2和JNK通路有可能成为肺纤维化诊断和治疗的下一个靶点。
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