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背景原发性肝癌（以下简称肝癌）是全球发病率排名第六位的恶性肿瘤,在全球范围内有一半以上的新发病例和死亡病例出现在中国。随着现代医学技术的进步,肝癌的治疗已经取得了巨大的进步,然而因其起病隐匿,早期诊断困难,70%-80%的患者就诊时已为进展期肝癌,预后并不理想。我国肝癌患者绝大部分病理类型是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）,按照巴塞罗那临床分期系统（barcelona clinic liver cancer,BCLC）,50%以上的肝癌患者在诊断时已属B期和C期,这些肝癌患者通常已没有手术指征,除了少部分可采取减少肿瘤负荷的局部疗法、提升生存时间的姑息疗法,大多数患者只能选择系统性疗法。此类晚期肝癌的系统疗法,主要为辅助化疗、靶向与免疫疗法等。免疫治疗被认为是一种非常有前途的肿瘤治疗策略,其治疗重点是重新激活肿瘤细胞所诱导的免疫抑制环境,改善抗肿瘤的免疫反应。然而,即使是目前最流行的抗程序性死亡受体（programmed death-1,PD-1）/程序性细胞死亡配体-1（programmed cell death legend 1,PD-L1）治疗和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic t-lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4）治疗,也只对一小部分人有效,这表明免疫治疗仍然面临着许多挑战。肝脏是一个重要的免疫器官,通过检测药代动力学特征可以检测到肝硬化患者对一些免疫治疗药物的反应,这些结果从理论上支持免疫治疗对治疗肝脏疾病的有效性。通过对肝脏免疫的研究发现,肝脏内的免疫调节机制倾向于诱导免疫耐受而不是主动免疫应答,这种免疫反应通过活化幼稚T细胞和启动免疫抑制机制来保持平衡。肝脏内免疫耐受的关键是组织内T细胞的耐受,其核心机制是诱导环境中抗原特异T细胞,产生相应的功能性耗竭或者凋亡现象,从而使微环境局部达到免疫逃逸的状态,同时导致抗原特异性T细胞在全身循环中减少从而诱导系统性的免疫耐受。在众多的免疫抑制机制中,PD-1及其配体PD-L1通路自发现以来就受到了极大的关注。PD-1主要表达在T、B、自然杀伤细胞以及髓系细胞上。对T细胞而言,PD-1可依靠与配体PD-L1或者PD-L2的相互作用机制,抑制T细胞的活化。在生理状态下,PD-L1和PD-1的表达对于维持自身免疫耐受、防止过度活化的T细胞所介导的免疫反应是必需的。但是在病理状态下,肿瘤细胞可以通过高表达PD-L1来逃避免疫细胞的攻击。对肝癌内PD-L1/PD-1通路的研究发现肝癌患者手术切除后肿瘤内PD-L1/PD-1的染色结果对预测其预后具有重要作用;除此之外,患者血清PD-L1的水平可作为识别肝癌早期复发和监测治疗结果的工具。因此PD-L1/PD-1通路近几年来在肝癌内研究热度很高,也是肝癌治疗方面最有希望的信号转导通路之一。基于以上背景,本研究第一部分收集了确诊为肝细胞癌的患者肿瘤切除术后新鲜的手术样本,对这些肿瘤组织中PD-L1的表达及肿瘤内浸润的淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）的情况进行分析,然后进一步分析了CD8+T细胞表面的PD-1的表达情况,通过与癌旁肝脏组织进行对比,了解了肝细胞癌肿瘤微环境内PD-L1的表达概况、T细胞浸润比例、尤其是肿瘤浸润性细胞毒CD8+T细胞表面PD-1的表达情况,此外还根据T细胞表面PD-1表达的不同分析了CD8+T细胞表面T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3,Tim-3）及αE整联蛋白和人粘膜淋巴细胞抗原1,CD103的表达情况。本研究的第二部分通过链霉亲和素-邻近生物素标记技术（proximity-dependent biotin identification,Bio ID）鉴定肝癌Hep G2细胞系中依赖PD-L1/PD-1相互作用的PD-L1邻近蛋白,并对这些鉴定出的邻近蛋白进行蛋白网络分析。本研究的第三部分从第二部分鉴定出的邻近蛋白中选择核糖体结合糖蛋白I（ribophorin I,RPNI）,检测其与Hep G2中PD-L1是否存在相互作用以及对PD-L1表达的影响。第一部分肝癌组织中PD-L1和CD8+T淋巴细胞PD-1的表达及其临床相关性评价方法:收集原发性肝细胞癌及癌旁术后新鲜组织样本,通过机械研磨制成单细胞悬液,然后用流式细胞术检测组织中PD-L1的表达及TILs的情况,对CD8+T细胞表面的PD-1的表达情况进行分析,通过与癌旁肝脏组织进行对比,了解肝癌肿瘤微环境内PD-L1的表达、T细胞浸润比例、尤其是肿瘤浸润性细胞毒CD8+T细胞表面PD-1的表达情况,研究这些指标和肝细胞癌患者临床性状之间的关系。结果:1.和癌旁肝脏组织相比,PD-L1在肝癌组织中的表达明显上调。肝癌组织中（n=68）PD-L1在所有活细胞中的表达比例为（13.41±8.908）%;癌旁肝脏组织中（n=68）该比例为（9.378±6.352）%,两组有明显区别（P＜0.0001）。与肝细胞癌患者临床特性相关性分析发现PD-L1在肝癌组织上的表达与患者临床分期,组织病理分级,肿瘤大小,患者性别,年龄等因素没有相关性。2.肝癌组织内浸润的CD3+T细胞的比例显著高于癌旁肝脏组织,肝癌组织中（n=68）CD3+T细胞占所有活细胞比例为（7.277±7.964）%,癌旁中（n=68）该比例为（4.564±4.237）%,两组之间存在显著性差异（P＜0.0001）。肝癌组织中CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例（48.44±17.5%）明显低于癌旁（64.91±11.46%）;CD4+T占CD3+T比例（45.58±16.53%）显著大于癌旁（25.41±11.41%）,肝癌组织中有CD4与CD8比例倒置现象。3.肝癌组织内浸润的CD8+T细胞根据PD-1的表达情况可细分为PD-1高表达(PD-1high)和PD-1中度表达(PD-1int)和PD-1阴性(PD-1neg)三群。肝癌组织内浸润的CD8+T细胞表面上PD-1+(PD-1high+PD-1int)及PD-1high的表达比例均高于癌旁肝脏组织。无论是在肝癌内还是癌旁肝脏组织内,Tim-3和CD103在CD8+T细胞中的表达均为PD-1high＞PD-1int＞PD-1neg,且在肝癌内的表达均高于癌旁肝脏组织（P＜0.0001）。PD-1+与PD-1high的比例,都和肿瘤大小有密切关系（P＜0.05）。4.肝癌组织中PD-L1的表达与TILs的相关性分析结果显示:肝癌组织中PD-L1的表达和CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、PD-1+CD8+T细胞、PD-1highCD8+T细胞的表达都具有相关性（P＜0.0001）。第二部分通过邻近生物素标记技术（Bio ID）鉴定肝癌Hep G2细胞中PD-L1邻近蛋白方法:为了解析PD-L1/PD-1通路的蛋白调控网络,本研究将过表达PD-L1的肝癌Hep G2细胞和过表达PD-1的Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞）混合培养后,采用邻近生物素标记技术对Hep G2中肿瘤内源性PD-L1信号转导通路上依赖PD-L1/PD-1相互作用的邻近蛋白进行拉拽,对这些蛋白进行液相色谱串联质谱LC-MS/MS蛋白测序,鉴定出Hep G2中与PD-L1/PD-1通路相关的PD-L1邻近蛋白并进行GO富集分析,KEGG代谢通路富集分析以及蛋白网络分析。结果:1.鉴定得到188个Hep G2细胞内依赖PD-L1/PD-1通路的PD-L1邻近蛋白,在String（https://string-db.org/cgi/network）网站上进行查询,去除名称重复及未被鉴定过的蛋白,剩下132个邻近蛋白。2.GO功能富集分析显示这些蛋白在多个生物过程中显著富集,其中主要包括核糖体（ribosome）,翻译起始（translational initiation）,核转录的m RNA分解代谢过程代谢过程（nuclear-transcribed m RNA catabolic process）。3.KEGG代谢通路富集发现这132个蛋白在三个通路上显著富集,其中富集最多的是核糖体通路,提示核糖体蛋白可能会参与PD-L1转录后翻译的调控。4.蛋白之间的相互作用分析显示相互作用最为密切的蛋白簇和翻译,RNA加工与蛋白运输有关。第三部分RPNI调控肝癌Hep G2细胞中PD-L1蛋白的表达方法:在大肠杆菌系统内表达和纯化了RPNI蛋白,用GST pull down方法验证其与肝癌Hep G2细胞（与稳定表达PD-1的Jurkat细胞共培养24小时后）内的PD-L1蛋白的互作关系,而后建立稳定敲低RPNI表达的Hep G2细胞,与对照组相比检测其细胞表面PD-L1表达的变化。结果:1.GST pull down实验未检测到RPNI与Hep G2细胞中PD-L1之间有强相互作用;2.Hep G2细胞内广泛表达RPNI,敲低Hep G2细胞内RPNI导致其增殖被抑制;3.敲低Hep G2内RPNI导致Hep G2表面PD-L1表达下调;4.敲低Hep G2内RPNI并未影响Hep G2表面CD44,CD90,Ep CAM等其它上皮细胞的膜蛋白的表达。结论1.肝癌组织PD-L1表达上调,CD8+TILs呈现高耗竭T细胞的特征（高表达PD-1、Tim-3和CD103）,肝癌组织内PD-L1的表达和CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、PD-1+CD8+T细胞、PD-1highCD8+T细胞的表达都具有相关性（P＜0.0001）。提示肝癌作为一种炎性肿瘤,其微环境内的免疫状态主要处于“适应性抵抗”阶段,且其免疫抑制状态与PD-L1/PD-1通路密切相关。2.使用邻近生物素技术（Bio ID）和质谱鉴定得到132个Hep G2细胞内依赖PD-L1/PD-1通路的PD-L1邻近蛋白。GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集发现这些蛋白富集在核糖体代谢过程及核糖体通路,这些结果提示核糖体蛋白可能会参与PD-L1转录后翻译的调控。3.从第二部分鉴定出的邻近蛋白中选择RPNI研究其调控肝癌Hep G2细胞中PD-L1的表达研究,结果显示其与Hep G2内的PD-L1没有强的相互作用关系。敲低了RPNI的Hep G2细胞表面PD-L1蛋白表达下调。提示RPNI作为寡糖基转移酶的一个亚基,可能参与PD-L1的翻译后修饰。