【摘 要】
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阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种在自然界广泛存在的革兰氏阴性菌,可导致新生儿和婴幼儿感染脑膜炎、菌血症和坏死性结肠炎,具有高致死率。化学消毒剂常被用来抑制食品中阪崎克罗诺杆菌的生长的同时,也带来化学污染和耐药性等问题。因此,寻求天然、有效的抑菌剂对于控制阪崎克罗诺杆菌的污染,保障食品安全来说具有重要意义。紫锥菊提取物（Echinacea Extract,EE）含有
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阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种在自然界广泛存在的革兰氏阴性菌,可导致新生儿和婴幼儿感染脑膜炎、菌血症和坏死性结肠炎,具有高致死率。化学消毒剂常被用来抑制食品中阪崎克罗诺杆菌的生长的同时,也带来化学污染和耐药性等问题。因此,寻求天然、有效的抑菌剂对于控制阪崎克罗诺杆菌的污染,保障食品安全来说具有重要意义。紫锥菊提取物（Echinacea Extract,EE）含有多酚、生物碱和菊苣酸等抑菌成分,且具有安全、无毒害等特点,然而作为天然产物其抑菌效果与化学合成消毒剂相比并没有优势。研究证实低pH可以显著提高天然产物的抑菌活性,而柠檬酸（Citric Acid,CA）不仅可以为天然产物提供低pH环境,同时与无机酸相比,CA作为小分子有机化合物更容易进入食源性致病菌细胞内,破坏其内环境平衡。因此,本研究将EE和CA联合起来抑制阪崎克罗诺杆菌的生长,从而提高天然物质对阪崎克罗诺杆菌的抑菌效果,并探究二者联合作用对阪崎克罗诺杆菌的抑菌活性、机理和应用,为开发一种新的天然抑菌剂提供理论支撑。本试验选取阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544作为试验菌株,通过琼脂稀释法确定EE对阪崎克罗诺杆菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）,在此基础上,以空白对照组、EE处理组和CA处理组作为对照,分析两种物质联用对阪崎克罗诺杆菌生长的影响,并通过对受试细菌的细胞膜电位、细胞膜完整性、细胞膜通透性、菌体蛋白、DNA含量、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量及细胞形态变化的研究来揭示EE和CA联合作用对阪崎克罗诺杆菌的抑菌机理。最后,以空白对照组、EE处理组和CA处理组作为对照,通过探究EE+CA对接种到不锈钢、纱布、竹片、木板表面的阪崎克罗诺杆菌的影响,来评估EE+CA对这些接触面的抑菌效果。抑菌活性研究结果:EE对阪崎克罗诺杆菌的MIC为60 mg/m L。生长曲线结果表明,与EE处理组和CA处理组相比,在相同的EE浓度和同一pH下,EE+CA组的抑菌效果显著高于EE组和CA组,平板计数结果与生长曲线结果类似,当pH≤2.5时,EE+CA组和CA组处理10 min后阪崎克罗诺杆菌全部失活,当EE+CA组的pH为3.0时,阪崎克罗诺杆菌在被处理0.5 h后全部失活。抑菌机理研究结果:与空白对照组、EE（1 MIC,pH 4.5）处理组和CA（pH 3.0）处理组相比,在处理相同的时间下,膜电位测定结果显示,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组的阪崎克罗诺杆菌细胞的荧光强度显著降低（P＜0.05）,细胞膜电位超极化现象严重;荧光显微镜检测结果显示,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色细菌数目显著增加,细菌细胞膜完整性破坏更加严重;流式细胞仪检测结果显示,EE+CA（1 MIC,pH3.0）组PI染色细菌比例显著升高,细菌细胞膜通透性增加;SDS-PAGE分析显示,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组菌体蛋白条带更淡,3 h后,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组菌体蛋白部分条带消失,进一步表明细胞膜受损导致蛋白泄露;DNA损伤试验表明,EE+CA（1 MIC,pH3.0）组DNA条带更暗,3 h后,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组DNA条带消失,说明菌体DNA损伤显著;菌体ROS含量变化结果显示,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组菌体胞内ROS含量显著减少（P＜0.05）,表明菌体细胞膜可能被破坏,使胞内ROS泄露;扫描电镜结果显示,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组的菌体细胞不再完整,变形严重,皱缩聚集现象更加明显;透射电镜结果进一步证实,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组细胞壁和细胞膜损伤,细胞内容物泄露严重。应用研究结果:与空白对照组、EE（1 MIC,pH 4.5）处理组和CA（pH 3.0）处理组相比,EE+CA（1 MIC,pH 3.0）组在处理30 min后,接触面上的阪崎克罗诺杆菌全部失活,抑菌效果显著高于另外两组（P＜0.05）。综上所述,与EE处理组和CA处理组相比,EE+CA组合处理能够有效的抑制阪崎克罗诺杆菌的生长,二者联用通过导致细胞膜电位改变、细胞膜完整性破坏、细胞膜通透性增加、蛋白含量减少、DNA损伤、ROS含量减少以及细胞形态改变而使细菌死亡。另外,EE+CA能够有效的抑制不锈钢、纱布、竹片、木板表面的阪崎克罗诺杆菌的生长,有潜力作为一种天然消毒剂应用于接触面的清洁杀菌之中。
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