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目的:研究冠心康干预体外ox-LDL不同剂量水平、不同时间窗口诱导的HepG2胆固醇代谢模型细胞,探讨冠心康基于内质网应激PERK-eIF2α信号通路调节胆固醇代谢平衡的机制,及其与调控胆固醇代谢的相关mi RNA的关系,进一步阐明中药冠心康可能的作用靶点及其最佳用药时点。方法:培养人肝癌细胞株HepG2细胞,并随机分为空白对照组、模型组、辛伐他汀组、冠心康组四组。同时制备SD大鼠冠心康及辛伐他汀含药血清。空白对照组采用HepG2细胞+含10%正常大鼠血清培养细胞72小时。其余各组分别采用20、40、80、160μg/m L浓度ox-LDL诱导HepG2细胞24小时,或80μg/m L浓度ox-LDL分别诱导HepG2细胞4h、8h、12h、24h、48h,建立不同诱导浓度及不同诱导时间的肝细胞胆固醇代谢模型。细胞造模后,模型组给予含10%正常大鼠血清的培养基、辛伐他汀组和冠心康组细胞分别给予10%相应药物的含药大鼠血清孵育细胞48小时（不同浓度诱导造模部分）或24小时（不同诱导时间造模部分）。收集各组细胞,采用油红O染色病理学方法观察HepG2细胞不同造模方法的胆固醇代谢情况及药物干预作用;HPLC-MS法测定细胞内胆固醇含量;提取各组细胞总RNA与蛋白质,采用real-time PCR法从基因水平检测SREBP2、LDLR、HMG-Co AR、ABCA1 m RNA表达水平;采用Western blot技术从蛋白水平检测PERK磷酸化、eIF2α磷酸化水平,以及SREBP2、LDLR蛋白表达;采用real-time PCR法观察转录后水平mi R-33a与mi R-122表达。结果:1冠心康对ox-LDL诱导的HepG2细胞胆固醇代谢的影响经不同浓度ox-LDL诱导,模型组HepG2细胞内胆固醇含量显著增加,与空白对照组比较,P＜0.01。经药理血清干预后,辛伐他汀、冠心康均能显著降低HepG2细胞内胆固醇含量,经与模型组比较,P＜0.01。经油红染色可见,随着ox-LDL诱导浓度的升高,模型组HepG2细胞内橙色脂滴较空白对照组明显增多,经辛伐他汀、冠心康含药血清同步孵育后的HepG2细胞,细胞内橙色脂滴显著减少。经ox-LDL诱导后,模型组HepG2细胞内胆固醇含量显著增加,与空白对照组比较,P＜0.01。辛伐他汀组各时间分组HepG2细胞内胆固醇含量明显降低,经与模型组比较,P＜0.01。冠心康组4小时、24小时、12小时诱导组胆固醇含量显著下降,经与模型组比较,P＜0.05。经油红染色可见,经不同时间ox-LDL诱导后,模型组HepG2细胞内橙色脂滴较空白对照组明显增加。同时经辛伐他汀、冠心康含药血清同步孵育后的HepG2细胞,细胞内橙色脂显著减少。2冠心康对HepG2细胞胆固醇代谢模型PERK-eIF2α信号通路的调控2.1不同剂量ox-LDL诱导后含药血清干预结果与空白对照组比较,模型组HepG2细胞ABCA1基因的表达量显著增加,但随着ox-LDL浓度增加,ABCA1的表达逐渐降低。与模型组比较,辛伐他汀组和冠心康组均能升高ABCA1基因的表达,P＜0.05。而相比模型组,两组药物组可显著降低ox-LDL诱导后HepG2细胞HMG-Co AR基因的表达水平,且浓度越高,抑制效果越明显,与模型组比较,P＜0.01。药物组SREBP2基因和蛋白的表达明显受到抑制,与模型组比较,P＜0.05,且随着浓度增高,对其基因抑制作用越弱,对SREBP2蛋白的抑制作用越强。两药均可上调LDLR在ox-LDL诱导后细胞中基因和蛋白的表达水平,冠心康对其的升高作用随浓度上升而增强。模型组低浓度诱导组PERK、eIF2α磷酸化水平显著升高,冠心康能够明显降低160μg/m L诱导组P-PERK蛋白水平,与模型组比较,P＜0.05。并且对其余浓度组皆有降低趋势。2.2不同时间ox-LDL诱导后含药血清干预结果经ox-LDL诱导不同时间,模型组HepG2细胞内ABCA1基因含量逐渐受到抑制,HMG-Co AR基因表达含量逐渐升高,其中,以ox-LDL诱导12小时时间点,其细胞ABCA1基因表达最低,与其他各组比较,P＜0.01;以ox-LDL诱导48小时后,其HMG-Co AR基因表达最高,P＜0.01。辛伐他汀和冠心康均能明显上调不同时间ox-LDL诱导后胞内ABCA1基因的表达以及抑制HMG-Co AR基因的表达,且冠心康组对ABCA1基因产生效应的时间早于辛伐他汀。不同时间ox-LDL诱导后胞内LDLR基因和蛋白的表达受到抑制,且随着时间延长抑制作用逐渐减弱。辛伐他汀和冠心康均能上调胞内LDLR基因和蛋白的表达,与模型组比较,P＜0.05,且冠心康对其上调作用随ox-LDL诱导时间逐渐增强。经ox-LDL诱导48h后,模型组内SREBP2的表达水平最高,与其他时间点相比,P＜0.01。辛伐他汀对SREBP2的抑制作用与ox-LDL诱导时间无统计学差异,冠心康对SREBP2基因和蛋白的抑制作用随着ox-LDL诱导时间的延长而增强。模型组ox-LDL诱导较短时间,其PERK、eIF2α磷酸化水平出现增高趋势,在ox-LDL诱导24h后出现回落趋势。冠心康对P-eIF2α的抑制作用在细胞损伤中晚期较明显,但与并无ox-LDL诱导时间无明显统计学差异。3冠心康对胆固醇稳态相关mi RNA的调控作用冠心康有下调不同浓度和不同时间ox-LDL诱导后HepG2细胞mi R-122基因表达水平,与模型组比较,P＜0.05,但其表达与ox-LDL诱导浓度和时间无明显统计学差异。用20μg/m L ox-LDL诱导HepG2细胞24h后,模型组细胞内出现爆发式的mi R-33a基因过表达,经组间比较,P＜0.01;从40μg/m L诱导组开始mi R-33的表达受到抑制,但仍高于空白对照组,随着浓度升高,该抑制效果逐渐减轻。辛伐他汀、冠心康均可能显著下调HepG2细胞mi R-33a的表达水平,与模型组比较P＜0.01。冠心康对较高浓度ox-LDL诱导后mi R-33a的抑制作用强于辛伐他汀,经组间比较,P＜0.05。结论:1采用ox-LDL诱导HepG2细胞可成功复制胆固醇代谢模型,冠心康可缓解细胞内胆固醇沉积,减缓胆固醇代谢失衡和细胞凋亡进程。2冠心康通过抑制PERK-eIF2α-SREBP2信号通路,上调ABCA1的表达,抑制HMG-Co AR,并上调LDLR的表达调节细胞内胆固醇代谢平衡。且细胞损伤初期冠心康作用可能通过PERK-eIF2α-SREBP2信号通路,而中晚期对ABCA1的调控更强,其通路调控作用时间早于辛伐他汀。3冠心康可抑制mi R-33a及mi R-122的表达,提高细胞对胆固醇的代谢作用,维持胆固醇平衡,且在中、重度胆固醇代谢失衡引起的细胞损伤中,冠心康对mi R-33a的作用较辛伐他汀更强。