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研究背景和目的原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）简称肝癌,位居世界上第六大最常见肿瘤,肝癌的死亡率居第二位。据统计,每年新增的肝癌病人约为70万,其中约有一半的病人位于我国。然而大部分肝癌患者诊断时已经处于癌症的中晚期,失去了最好的手术切除时机。目前肝癌的治疗手段主要包括手术切除和肝移植等,术后可以采用放化疗、肝动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）或靶向治疗等方法。但是由于肝癌的异质性,对于常规的放化疗效果并不明显,而小分子靶向治疗药物索拉菲尼,其对于晚期肝癌患者的生存期延长并不理想。肝癌干细胞（liver cell stem cells）是肝癌中一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,被认为是肝癌患者术后复发和化疗耐药的最主要原因。已有研究报道肝癌干细胞可以利用CD133、CD24、CD90和Ep CAM等干细胞表面标志物进行分选鉴定。CD24可以通过STAT3介导的Nanog调节促进肝脏干细胞的自我更新和肿瘤发生。肝癌干细胞在肝癌的发生发展和复发耐药等方面起着极其重要的作用,因此深入探索研究肝癌干细胞的调控机制显得尤为重要,这也可能成为攻克肝癌的一个重要途径。micro RNAs是一类长度为20-22 nt的非编码小RNA分子,可以通过与目标m RNA的3’端非翻译区（3’-untranslated regions,3’UTR）结合来抑制翻译或诱导m RNA降解,以达到其调控细胞的增值、分化、凋亡和迁移等多种生物学行为。micro RNA在各种生物学过程中发挥着重要的调控作用。根据不同的肿瘤环境,micro RNA可以作为肿瘤抑制基因或癌基因来调控肿瘤的发生和发展。例如,miR-429通过靶向Rb结合蛋白4来调控肝癌起始细胞。已有研究报道miR-206在骨骼肌胚胎发育过程中受到雌二醇的调控。此外,miR-206在不依赖雌二醇生长的三阴性乳腺肿瘤中高度表达,是乳腺癌患者整体生存率较差的预测因子。还有报道称,miR-206抑制了肺癌细胞和胃癌细胞的增殖和侵袭,提示该miRNA参与了肿瘤的进展。然而miR-206是否在肝癌干细胞的分化过程中起到调控作用并不是十分清楚。前期研究发现miR-206在非酒精性脂肪肝患者的样本中可以持续监测到,在饮食肥胖的小鼠模型中,miR-206的治疗作用导致肝脏内脂质和葡萄糖的产生减少。已有研究报道miR-206可通过EGFR抑制肝癌的生长。但miR-206在肝癌干细胞中的作用未见报道。因此,本课题将通过体内、体外实验探明miR-206对肝癌干细胞的调控作用;进一步通过生物学分析结合经典的生物学技术探索miR-206调控肝癌干细胞的分子机制。研究方法:1.流式细胞仪分选CD133和Ep CAM阳性的肝癌细胞及阴性对照细胞;2.利用Realtime-PCR检测肝癌细胞球中miR-206的表达水平;3.利用Realtime-PCR检测CD133和Ep CAM阳性肝癌细胞中miR-206的表达水平;4.利用Realtime-PCR检测耐药肝癌组织中miR-206的表达水平;5.利用慢病毒系统建立稳定过表达miR-206的肝癌细胞系SMMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系;6.SMMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系采用低粘附成球实验观察过表达miR-206后对肝癌干细胞自我跟新能力的影响;7.MMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系采用体外有限稀释实验观察过表达miR-206后对肝癌干细胞生物学特性的影响;8.SMMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系采用流式检测干细胞标志物观察过表达miR-206后对肝癌干细胞比例的影响;9.SMMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系采用Realtime-PCR检测分析各种干性标志物和Mark等观察过表达miR-206后对肝癌干细胞生物学特性的影响;10.将不同浓度的SMMC-7721 miR-206及其对照细胞分别接种NOD-SCID小鼠皮下,检测miR-206对肝癌干细胞体内成瘤的影响;11.SMMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系加入不同浓度的索拉菲尼或顺铂,通过CCK8实验检测miR-206过表达肝癌细胞与对照细胞的生长情况;12.SMMC-7721 miR-206、HCCLM3 miR-206及其对照细胞系加入不同浓度的索拉菲尼或顺铂,通过流式凋亡检测分析miR-206过表达肝癌细胞对索拉菲尼和顺铂的敏感性;13.利用Realtime-PCR、western-blot、报告基因检测和生物学分析等方法研究miR-206对EGFR等信号通路的调控;14.利用EGFR的特异性抑制剂（吉非替尼）进行成球和流式检测实验,进一步明确miR-206通过EGFR调控肝癌干细胞;15.利用病人肝癌组织分析miR-206和EGFR相关性。研究结果:1.miR-206在肝癌干细胞中表达降低。2.过表达miR-206可抑制肝癌细胞SMMC-7721和HCCLM3的自我更新能力。3.过表达miR-206可降低肝癌细胞SMMC-7721和HCCLM3的CD133或Ep CAM的阳性比例。4.过表达miR-206可抑制肝癌细胞SMMC-7721的体内成瘤能力。5.过表达miR-206的肝癌细胞SMMC-7721、HCCLM3对肝癌靶向药物索拉菲尼更加敏感。6.过表达miR-206的肝癌细胞SMMC-7721、HCCLM3对肝癌常规化疗药物顺铂更加敏感。7.在肝癌干细胞中miR-206调控EGFR信号通路。8.EGFR特异性抑制剂Gefitinib可消除miR-206对肝癌干细胞的调控作用。9.肝癌样本分析发现miR-206和EGFR呈负相关关系。结论:在本研究中,在CD133或Ep CAM阳性的肝癌干细胞和富集肝癌干细胞的肝癌球体中miR-206的表达水平表达被显著下调,而过表达miR-206基因抑制肝癌干细胞的扩增。此外,我们发现EGFR是miR-206的直接作用靶点。EGFR抑制剂吉非替尼消除了miR-206过表达肝癌细胞与对照细胞肝癌干细胞比例的差异和自我更新能力。我们还发现miR-206可以影响肝癌细胞对索拉非尼和顺铂的耐药性。综上所述,我们的研究表明miR-206是一个新的癌症干细胞标记物,在肝癌干细胞扩增和肝癌耐药中起着重要作用。