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目的:耳聋是最常见的遗传病之一,在新生儿中发病率高达1/800～1/1000。既往研究表明,造成耳聋的原因是多方面,其中最主要的是遗传因素,60％的耳聋都是由遗传缺陷引起的。遗传性耳聋可分为两种:一种为综合征性耳聋(syndromic hearing impairment,SHI),另一种为非综合征性耳聋(non-syndromic hearing impairment,NSHI),而70%的遗传性耳聋表现为非综合征性耳聋(NSHI)。国内的耳聋分子流行病学分析研究报道显示,绝大多数非综合征性耳聋仅与为数不多的几个基因突变相关,如线粒体12srRNA、GJB2、SLC26A4等。本研究利用基因诊断的方法调查邯郸市聋哑学校非综合征型耳聋患者的常见分子病因,对线粒体12srRNA基因、GJB2基因和SLC26A4基因编码区突变进行分析,以明确非综合征型耳聋患者发病的分子学基础,为耳聋基因的筛查和产前诊断提供实验和理论依据。
方法:
1.收集100名聋哑学校非综合征型耳聋患者血细胞标本,保存于-80℃低温冰箱,用于GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体12srRNA的聚合酶链扩增反应(polymerase chain reaction,PCR),同时填写耳聋基因诊断知情同意书遗传病信息登记表及耳聋病人信息登记表,建立血细胞标本库。
2.用聚合酶链扩增反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法,检测线粒体12srRNA基因的2个基因片段、GJB2基因的2个基因片段和SLC26A4基因20个外显子的表达情况。
3.应用直接测序法分别对GJB2基因的2个基因片段、线粒体12SrRNA基因的2个基因片段及SLC26A4基因20个外显子进行直接测序。
结果:
1.耳聋分型
根据世界卫生组织(WHO)《障碍、残疾和残废的国际分类》(1980年)中听力损失分级标准对100例河北省邯郸市特教学校耳聋学生进行评定,100例研究对象均被诊断为重度以上双侧耳聋且均为非综合征型耳聋。在100例研究对象中有6例SLC26A4突变导致的内耳最常见的畸形前庭水管扩大(enlarged vestibular agueduet,EVA)。
2.药物性耳聋情况
100例研究对象中,被测者聋前或其母亲孕期明确应用过氨基糖甙类抗生素者30例(30%),其中以单独应用庆大霉素最多见(22例),丁胺卡那霉素2例、小诺霉素4例,联合用药患者中庆大霉素加链霉素2例;30例中有4例(7.5%)存在线粒体基因A1555G位点突变。用药的时间主要集中在研究对象婴幼儿时期或其母亲妊娠期,用药原因多为感冒、发烧和腹泻,具体的用药剂量不详。
3. PCR检测结果
以100例患者的DNA样本(线粒体12S rRNA基因的2个基因片段、GJB2基因的2个基因片段及SLC26A4基因20个外显子)进行PCR扩增,扩增产物片段大小与预期相符。
4.测序结果
用Mutation Surveyor软件对测序结果进行比对分析。DNA测序结果用Gene Tool1.0软件与NCBI网站公布的GJB2的标准序列(NC-000013.9)、SLC26A4的标准序列(NC-000007.13)及mtDNA的标准序列(NC-001807)进行比对。结果发现:被检测的100名聋哑学校非综合征型耳聋患者中,携带线粒体12SrRNA基因A1555G点突变的10例(占10%);携带线粒体12SrRNA基因C1494T点突变的2例(占2%);携带GJB2基因235delC纯合突变的18例(占18%),携带GJB2基因复合杂合突变的10例(占10%);携带SL.C26A4基因ⅣS7-2A＞G纯合突变的8例(占8%),携带SLC26A4基因ⅣS7-2A＞G杂合突变的6例(占6%)。235delC是GJB2基因主要的致病突变形式,GJB2的235delC纯合或GJB2复合杂合突变在此次致病突变中占51.8%。
结论:
河北省邯郸地区特教学校耳聋患者存在较高的GJB2基因235delC、线粒体12SrRNA基因A1555G和SLC26A4基因ⅣS7-2A＞G突变发生率,线粒体12SrRNA基因A1555G突变发生率高于全国平均水平,但GJB2基因仍为河北省邯郸地区最主要的致病突变形式。在河北省邯郸市耳聋人群中线粒体12SrRNA基因A1555G、GJB2基因和SLC26A4基因的突变的发生率较高,因此通过其突变筛查可以有效避免高危人群出现耳聋。