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目的多糖用于免疫增强和肿瘤治疗方面的价值,早已为人们所关注。GCP（Glycyrrhiza Uralensis Polysaccharide,甘草多糖）是中国传统中药甘草的主要药效成分之一,临床实践和实验研究都肯定了甘草多糖的抗肿瘤作用。课题组已建立了稳定的甘草多糖提取和含量测定方法,本实验室分离得到的精制甘草多糖经研究具有良好的抗肿瘤作用。甘草多糖是一种大分子多糖,口服生物利用度极低,前期课题组已经证明口服甘草多糖通过调节肠道菌群发挥抗肿瘤作用,然而GCP如何干预肠黏膜免疫细胞发挥抗肿瘤作用的具体机制有待进一步探讨。γδT细胞是一群表达TCRγδ（T cell receptor,T细胞受体）的CD3+固有免疫细胞,是肠上皮淋巴细胞的重要组成部分,主要位于小肠上皮细胞的基底外侧。γδT细胞不受MHC（major histocompatibility complex,主要组织相容性复合体）限制,对不同来源的多种肿瘤细胞具有杀伤活性,并具有免疫调节功能,在肿瘤防治中起着不可替代的作用。γδT细胞是一群亚型种类多、表型多变且高度异质性的细胞,其中IFN-γ+γδT细胞在肿瘤免疫监视和杀伤中起重要作用。TLR4（Toll-like receptor 4,Toll样受体4）是细胞膜表面模式识别受体的一种,其可表达在多种上皮及免疫细胞上,可以识别革兰氏阴性细菌的主要成分脂多糖或者坏死的细胞释放的内源性分子,进而激活免疫细胞。TLR4信号是肠上皮细胞“感受”肠道微生态改变并促进相应细胞因子表达的关键通路之一,进而影响肠黏膜多种免疫细胞,如肠上皮细胞衍生的细胞因子IL-12和IL-18可促进γδT细胞向IFN-γ+亚型分化。综上,本研究首先探讨了甘草多糖干预肠黏膜γδT细胞分化的抑瘤作用,进一步利用肠上皮Tlr4特异性敲除基因鼠探讨甘草多糖影响肠黏膜γδT分化的分子机制,为甘草多糖抗肿瘤研究提供实验基础,也丰富中医“扶正培本”肿瘤治则治法的内涵。方法1.甘草多糖影响肠黏膜γδT分化发挥抗肿瘤作用首先以甘草多糖和PBS（Phosphate Buffered Saline,磷酸缓冲盐溶液）分别灌胃干预两组荷瘤小鼠（SPF-PBS、SPF-GCP）21天,评价荷瘤鼠的出瘤时间、肿瘤体积、肿瘤体质量比、免疫组化染色评估甘草多糖对肿瘤细胞增殖情况的影响以及肿瘤组织浸润CD3+、CD27/γδT的数量,评估小鼠生存质量、脾脏体积及指数的变化,免疫组化及免疫荧光检测脾脏CD3+T及γδT细胞数量。流式细胞术检测肠黏膜CD3+/CD4+/CD8ˉT、CD3+/CD8+/CD4ˉ的比例,γδT激活表型CD27、NKG2D以及IFN-γ的表达情况。明确甘草多糖通过影响肠黏膜γδT分化发挥抗肿瘤作用。2.甘草多糖影响肠黏膜γδT细胞分化的分子机制研究2.1甘草多糖通过影响肠黏膜TLR4/My D88非依赖信号通路发挥抑瘤作用甘草多糖灌胃干预SPF荷瘤鼠,刮取小鼠肠黏膜,RT-q PCR检测TLR4/My D88非依赖信号通路上的关键节点m RNA的表达水平（TLR4、TRAM、TRIF、TBK-1、STAT-1、IRF1、IRF2）;WB检测TLR4/My D88非依赖通路关键蛋白表达水平（TLR4、TRAM、TRIF、TBK-1、STAT-1、p-STAT-1、IRF1、IRF2）;ELISA检测肠黏膜细胞因子TNF-α、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21的浓度,明确甘草多糖对肠黏膜TLR4/My D88非依赖信号通路的影响,进而促进相关细胞因子的释放。2.2利用肠上皮Tlr4特异性敲除小鼠探讨甘草多糖影响肠黏膜γδT分化的分子机制应用CRISPR/Cas9技术构建肠上皮Tlr4特异性敲除小鼠(Tlr4f/fcre T),分别灌胃甘草多糖和PBS,流式细胞术检测肠黏膜CD3+/γδT的比例,γδT激活表型CD27、NKG2D以及IFN-γ的表达情况,考察甘草多糖对Tlr4f/fcre T荷瘤小鼠肠黏膜γδT的分化的影响。评价Tlr4f/fcre T荷瘤小鼠的出瘤时间、肿瘤体积、肿瘤体质量比、免疫组化染色评估甘草多糖对肿瘤细胞增殖情况的影响以及肿瘤组织浸润CD3+、CD27/γδT的数量,评估小鼠生存质量、脾脏体积及指数的变化,免疫组化检测脾脏CD3+T细胞数量,免疫荧光检测脾脏γδT细胞的数量明确甘草多糖影响肠黏膜γδT细胞分化抑瘤作用的分子机制。结果1.甘草多糖干预肠黏膜γδT细胞分化发挥抗肿瘤作用实验结果显示:相较于灌胃PBS组SPF荷瘤小鼠,灌胃甘草多糖组SPF荷瘤小鼠出瘤时间延迟,肿瘤体积、肿瘤体质量比显著下降,肿瘤增殖标记物Ki67阳性率显著下降,肿瘤组织浸润CD3+、CD27/γδT的数量显著增多。小鼠生存质量明显改善,脾脏体积及指数明显升高,脾脏CD3+T细胞及γδT数量显著增加。与灌服PBS组SPF荷瘤小鼠相比,甘草多糖组SPF荷瘤小鼠肠黏膜CD3+/γδT细胞比例显著升高,且γδT激活表型CD27、NKG2D以及IFN-γ的表达显著上升。2.甘草多糖影响肠黏膜γδT细胞分化的分子机制研究2.1甘草多糖上调肠上皮TLR4/My D88非依赖信号通路相关因子发挥抑瘤作用研究结果显示:相较于灌胃PBS组SPF荷瘤小鼠,灌胃甘草多糖组SPF荷瘤小鼠肠上皮TLR4/My D88非依赖通路关键节点TLR4、TRAM、TRIF、TBK-1、STAT-1、IRF1、IRF2的m RNA水平显著上调,同时上述关键节点蛋白表达水平也增高,同时p-STAT-1水平显著提高。ELISA检测肠黏膜局部细胞因子TNF-α、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21显著升高。2.2利用肠上皮Tlr4特异性敲除小鼠验证甘草多糖干预肠黏膜γδT分化抑瘤的分子机制实验结果表明,灌服甘草多糖的Tlr4f/f cre T荷瘤小鼠相较于灌服PBS Tlr4f/f cre T荷瘤鼠,两组在肠黏膜CD3+/γδT细胞比例未见明显差异,且γδT激活表型CD27、NKG2D以及IFN-γ的表达未见明显差异。进一步发现,相较于灌胃PBS组Tlr4f/f cre T荷瘤小鼠,灌胃甘草多糖组Tlr4f/f cre T荷瘤小鼠出瘤时间、肿瘤体积、肿瘤体质量比未见明显差异,肿瘤增殖标记物Ki67阳性率,肿瘤组织浸润CD3+、CD27/γδT的数量未见明显差异。小鼠生存质量未见明显改善,脾脏体积及指数未见明显改变,脾脏CD3+T细胞及γδT数量未见明显差异。结论1.首先验证了甘草多糖通过干预肠黏膜γδT分化发挥抗肿瘤作用;2.阐明了甘草多糖通过肠上皮TLR4/My D88非依赖信号通路,影响肠黏膜细胞因子的释放,干预γδT细胞分化,最终发挥抗肿瘤的分子机制。