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FAM76B(Family with sequence similarity 76B),又称 MGC33371,其基因定位于人染色体11q21。FAM76BcDNA全长1020bp,编码339个氨基酸,FAM76B蛋白定位于细胞核中。本实验室前期通过酵母双杂交实验得到证实,FAM76B与人PGRN蛋白存在相互作用,但目前对于FAM76B的具体生物学功能所知甚少。其中与FAM76B功能相关的PGRN(Progranulin,颗粒蛋白前体),又名GEP(Granulin-epithelin precursor),proepithelin,PCDGF(PC cell derived growth factor)。PGRN是一种生长因子,其在组织中广泛分布且功能多样。目前已报道,PGRN参与了许多生理及病理过程,如胚胎发育、软骨生成、神经发育、损伤修复、炎症和免疫反应,额颞叶变性(Frontotemporal Lobar Degeneration,FTLD)、肿瘤的发生和转移等,但其生物学功能还不是十分清楚。因此,通过对FAM76B的功能研究,将对PGRN的生物学功能分子机制的阐明具有重要的意义。本课题的具体研究内容包括以下三方面:1.不同长度FAM76B启动子的克隆及其活性检测:通过查找NCBI,克隆获得FAM76B 5’-UTR上游2.1kb区域的基因片段,在验证其生物活性后,进一步通过生物信息学软件分析,通过分子克隆手段分别获得长度为1376bp、811bp及395bp的3个启动子截短体。将上述四个不同长度的启动子片段分别连接到报告基因载体 pGL3 Basic-mCherry 及 pGL3 Basic-Luciferase 中,然后通过转染HEK293细胞,并检测报告基因mCherry或Luciferase表达,以进一步确定不同长度启动子的转录活性;2.预测FAM76B启动子区域可能结合的转录因子及转录因子的功能验证:根据FAM76B不同长度启动子活性的变化以及对启动子区域进行生物信息学分析,查找可能与其结合并与其功能相关的转录因子。分别对这些转录因子进行克隆,并将它们分别克隆到真核表达载体pAd5-E1-CMV中,最后将表达这些转录因子的真核表达载体与不同长度启动子活性报告载体分别共转染HEK293细胞,通过检测启动子活性报告载体上报告基因mCherry的表达变化来进一步验证这些转录因子的功能;3.FAM76B敲除的HEK293细胞与正常HEK293细胞中与FAM76B启动子区域相结合的转录因子表达变化检测:利用本实验室已建立FAM76B敲除的HEK293细胞系,采用Real-Time PCR方法检测相应转录因子相比于正常HEK293细胞的表达变化。通过以上研究取得了以下结果:1.成功克隆获得四种不同长度的FAM76B启动子,并构建获得相应启动子活性报告载体,通过转染HEK293细胞检测报告基因的表达,结果表明,四种FAM76B启动子均具有启动转录活性,且在这四种启动子中,长度越短启动转录活性越强;2.对FAM76B启动子区域进行生物信息学分析预测,获得14种可能与FAM76B启动子功能相结合的转录因子,分别为E2F1、AP-2alpha、USF1、C-MYB、SP1、c-Ets-1、AP1、STAT5A、ATF、RAR-alpha1、SRF、PU.1、AREB6及ATF1。通过分子克隆手段获得表达上述14种转录因子的真核表达载体,并通过将上述表达载体与携带有不同长度启动子的启动子活性报告载体子共转染HEK293细胞,检测报告基因表达变化。结果表明,转录因子 AP1、c-Ets-1、SRF、PU.1、ATF1、STAT5A 及USF1 对 FAM76B 启动子转录活性具有促进作用,转录因子E2F1及C-MYB对FAM76B启动子转录活性具有抑制作用;3.利用RT-PCR检测正常HEK293细胞及FAM76B基因敲除的HEK293细胞中上述对FAM76B启动子活性具有调控作用的转录因子表达变化,结果表明,转录因子 AP1、c-Ets-1、PU.1、ATF1、STAT5A、USF1 及 E2F1 在 FAM76B敲除HEK293细胞中表达上调,其中转录因子PU.1、ATF1、STAT5A及E2F1上调明显;转录因子SRF和C-MYB在FAM76B敲除HEK293细胞中表达均明显下调。综上所述,本课题通过对不同长度的FAM76B启动子区域进行克隆,并对不同长度启动子活性进行研究,发现在一定启动子长度范围内其启动子活性随长度增加而降低;同时通过对启动子区域进行生物信息学分析,成功克隆获得并验证了多种可能对FAM76B启动子活性有调节作用的相关转录因子。通过上述研究为阐明FAM76B基因的表达调控机制奠定基础,并且进一步为研究FAM76B及PGRN生物学功能的分子机制提供了帮助。