背景与目的近年来,我国糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)患病率不断增加,国际糖尿病联盟的糖尿病地图(Diabetes Atlas)数据显示,中国糖尿病患者人数从2010年的4315万剧增至2013年9840万,患病总人口数居全球首位。特别是北京、上海及包括珠江三角洲等发达地区,DM患病率已接近欧美发达国家的水平,给国家带来沉重的经济及社会负担。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病患者最常见的微血管并发症之一。就全球而言,DR是目前世界范围内青壮年劳动人群首要的致盲原因,同时也是50岁以上患者双眼盲主要原因之一。就中国而言,有文献报道,我国糖尿病患者中DR的患病率16%-43.1%,世界卫生组织数据也显示,全球DR的发病率正逐年增加,因此,关于DR的研究及相关治疗迫在眉睫。糖尿病视网膜病变的发病机制是近年来的研究热点与重点,复杂的病因学给预防和治疗带来困难。DR的发病基础是长期、慢性的高血糖症。长期的高血糖环境使血-视网膜屏障受损,进一步导致周细胞的进行性丢失毛细血管周细胞选择性丢失、内皮细胞凋亡、血管通透性增强,从而引起一系列的眼底病变,如微血管瘤、出血斑点、硬性渗出、棉絮斑、静脉串珠、视网膜内微血管异常及黄斑水肿等,广泛的缺血会引起视网膜或视盘的新生血管、视网膜前出血、玻璃体积血甚至牵拉性视网膜脱离,从而引起严重的视力障碍。然而DR具体发病机制复杂,尚不明确。目前国内外普遍认为DR的发病有多种细胞、分子机制等共同参与导致的结果。目前,DR发病机制主要有以下几种假说：慢性炎症机制、视网膜血流动力学改变学说、氧化应激学说、基因多态性和神经退行性改变等机制。几种机制相互包含,互为因果共同构成复杂的发病机制系统。另外,研究显示,在糖尿病的微环境下,视网膜上的多种细胞的结构和功能发生异常,包括视网膜血管内皮细胞紊乱,神经节细胞的凋亡、Muller细胞的代谢异常,以及色素上皮细胞(pigment epithelial cells,RPE细胞)均会不同程度的受损。人们逐渐意识到DR进程同时也是一个慢性炎症的过程,伴随着很多炎症因子的激活和表达异常。国际上最新倾向于将之称为“糖尿病性视网膜病变”,这说明炎性损伤,包括氧化应激、细胞凋亡和细胞增殖等一系列的过程,是糖尿病视网膜病变发展的关键。近年来,DR与氧化应激的关系受到越来越多的关注,氧化应激是指氧自由基(reactive oxygen species, ROS)过量的生成,导致细胞内抗氧化防御系统受损,进而造成组织损伤代谢异常细胞因子活化以及细胞凋亡等。大量的研究表明,DR初期,ROS及一氧化氮(nitric oxide, NO)增加。氧化应激反应对DR的发展,尤其是对视网膜内皮细胞功能的失调及死亡具有重要作用。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)属于热休克蛋白家族中的一员,它是血红素代谢过程的一个限速酶,可通过诱导生成的产物发挥作用。HO-1催化血红素生成游离铁、一氧化碳和胆绿素,胆绿素又在胆绿素还原酶的作用下,迅速转化为胆红素。HO-1在多种情况下都能诱导生成：比如在氧化应激,紫外线照射,缺血后修复以及重金属,多种细胞因子以及一氧化氮(nitric oxide,NO)等都可以诱导。既往研究证实,在体外细胞培养及动物模型中,HO-1在RPE细胞、内皮细胞、光感受器细胞、神经节细胞、Muller细胞中均有表达,在应激状态下其表达增高。有研究发现,血红素可以有效的诱导糖尿病大鼠视网膜HO-1的表达,Muler细胞可能是调控HO-1表达的主要应答细胞传统观点认为,HO-1功能主要有抗氧化,抗凋亡以抗炎以及细胞保护的作用。氧化应激最能诱导HO-1生成。而胆红素被认为是一个有效的氧自由基清除剂,在氧化应激反应中,对细胞具有保护作用。游离铁被认为对细胞会有损伤作用,但是游离铁可以在体内结合成为铁蛋白,铁蛋白参与了铁代谢过程中的抗氧化作用。然而近年来,人们发现HO-1除了有细胞保护作用外,还具有重要的促新生血管化形成的作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)等可以通过诱导HO-1的表达来调控新生血管化。而近年来,VEGF抑制剂成功应用于DR的治疗。它主要通过拮抗作用来降低血管通透性、调控血-视网膜屏障通透性以及抑制新生血管生成,从而达到促进视网膜内渗液吸收作用。Ranibizumab(Lucentis,雷珠单抗)作为第二代人源化的抗VEGF抗体片段,其专门设计为玻璃体腔注射使用。Lucentis已经被美国FDA批准上市,主要应用于湿性年龄相关性黄斑病变(wet age-related macular degeneration,wet-AMD)及视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿的治疗。现在亦有学者将其应用于DR的治疗,并取得良好的疗效。另外有研究发现HO-1在高糖培养的视网膜细胞以及糖尿病动物模型的视网膜上存在异常表达。但是关于HO-1在DR患者全身及局部的表达情况尚不清楚。为了探讨HO-1在DR发病机制中的作用,本研究观察了HO-1在2型糖尿病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mono-nuclear cells,PBMCs)、血清液以及玻璃体液中的表达,以期为阐明DR的发病机制、寻求新的治疗靶点提供理论依据和实验基础。方法1.选择糖尿病病程大于6个月的2型糖尿病患者,根据临床表现和诊断将其分为无糖尿病视网膜病变的糖尿病组(diabetic mellitus non-diabetic retinopathy group,DM-NDR组)及糖尿病视网膜病变组(DR组),其中DR组中包括非增生型DR(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)组及增生型DR(proliferative retinopathy, PDR)组。选择同期行体检的健康志愿者作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测外周血单个核细胞(peripheral blood mono-nuclear cells, PBMCs)中HO-1mRNA的表达水平,包括DM-NDR组18例、NPDR组24例,PDR组22例及对照组20例,比较各组之间HO-1mRNA表达水平的差异。同时收集糖尿病患者血清共34例,包括DM-NDR组10例、NPDR组10例、PDR组14例及对照组13例采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测各组血清中HO-1蛋白表达水平的差异。2.收集玻璃体液共49例,其中包括PDR患者共20例、特发性黄斑裂孔(idiopathic macular hole, IMH)患者9例,增生型玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)患者14例、以及术前玻璃体腔注射Lucentis的PDR患者(Lucentis-PDR组)6人。采用ELISA检测各组玻璃体液中HO-1蛋白表达水平的差异。3.分析外周血单个核细胞及血清、玻璃体液中HO-1表达水平与各理化指标之间的关系。结果l.qRT-PCR检测发现,DR组、DM-NDR组以及对照组PBMCs中HO-1mRNA相对表达量分别是0.015±0.007、0.021±0.01、0.027±0.013,差异有统计学意义(F=10.888；P<0.001)。其中,DR组HO-1mRNA的相对表达量明显低于DM-NDR组(P=0.014)：DM-NDR组与对照组比较差异无统计学意义(P=0.109)。 PDR组PBMCs中HO-1mRNA相对表达量为0.0125±±0.007,显著低于NPDR组(0.0178±0.007)(t=-3.052, P=0.004)。ELISA检测结果发现,DR组(1.347±1.179ng/m)、DM-NDR (1.092±0.630ng/ml)组血清内HO-1含量较正常对照组(0.931±0.336ng/ml)相比,表达均有增加趋势,但差异无统计学意义(P=0.160),其中DR组中,NPDR组(1.540±1.193ng/ml)与PDR组(1.21±1.195ng/ml)血清HO-1表达差异无统计学意义(P=0.219)。2.ELISA检测结果发现,PDR组玻璃体液HO-1表达(1.091±1.112ng/ml)均高于IMH组((0.573±0.034ng/ml)、PVR组(0.642±0.101ng/ml)以及Lucentis-PDR组(0.782±0.130ng/ml),差异具有统计学意义(P=0.004),两两比较发现,PDR组与Lucentis-PDR组中HO-1表达均高于IMH组,差异具有统计学意义(Z=2.929,P=0.020；Z=-2.744,P=0.036)。3.PBMCs中In(HO-1)mRNA表达水平与收缩压(β=-0.011,P=0.001)及糖化血红蛋白(β=0.088,P=0.008)之间存在显著相关性。血清中HO-1蛋白表达水平与血肌酐(β=0.002,P=0.001)之间存在显著相关性。我们研究并没发现玻璃体液中HO-1蛋白表达水平与各理化因子的相关性。结论1、PDR组在PBMCs HO-1mRNA表达显著低于NPDR组,但是在血清中PDR、NPDR、DM-NDR组及对照组HO-1蛋白表达差异无统计学意义。2、PDR组玻璃体液中HO-1蛋白表达明显高于IMH对照组,而与PVR组及Lucentis-PDR组HO-1蛋白表达差异不具有统计学意义。3、HO-1在DR患者外周血及玻璃体液中的异常表达,提示了HO-1可能参与了糖尿病视网膜病变的发生与发展。