论文部分内容阅读
目的:近年来研究发现,DNA甲基化是肿瘤发生发展的重要机制之一。DNA甲基化常发生于抑癌基因启动子区(CpG岛),通过抑制启动子功能使抑癌基因表达沉默,导致肿瘤发生。本实验通过对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因启动子甲基化的研究,来探讨SFRP-1启动子甲基化与前列腺癌的关系及三氧化二砷诱导前列腺癌细胞凋亡的机制。方法:通过CCK8方法检测三氧化二砷对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测三氧化二砷对前列腺癌PC-3细胞凋亡的作用;采用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因启动子CpG岛甲基化;免疫荧光法检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞SFRP-1表达;荧光定量PCR法检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因mRNA表达情况;Western Blot检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1蛋白表达情况。结果:CCK8检测发现:三氧化二砷能明显抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖,并呈时间剂量依赖性(P<0.05)。流式细胞术结果显示:在三氧化二砷梯度浓度为(0,1,2.5,5,10,20)μmol/L处理PC-3细胞24h和48h后,流式细胞检测凋亡率分别为:(5.5±0.87,8.8±1.43,15.5±2.72,26.9±1.63,36.7±2.12和55.8±3.87)%;(7.9±1.32,11.2±1.56,25.8±2.84,38.7±3.56,57.2±2.53,70.9±5.04)%,三氧化二砷处理后凋亡明显增加(P<0.05)。BSP结果显示:前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因启动子两个CpG岛均有甲基化,甲基化程度分别为85%和71%;而加入10μmol/L三氧化二砷作用24小时后,两个CpG岛甲基化程度分别减少到54.2%和69.8%,对第一个CpG岛去甲基化作用明显;免疫荧光结果显示:正常前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因表达很少,而应用10μmol/L三氧化二砷作用24小时后,SFRP-1基因的表达显著增加(P<0.05)。荧光定量PCR发现:三氧化二砷处理后,PC-3细胞中SFRP-1mRNA表达显著性增加,随着三氧化二砷浓度的增加SFRP-1的表达量逐渐增加,有明显差异(P<0.05)。Western Blot发现:三氧化二砷处理后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1蛋白表达较正常对照组增多,且随着三氧化二砷作用浓度的增加,SFRP-1蛋白表达显著性增加(P<0.05)。结论:雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中存在SFRP-1基因启动子CpG岛甲基化,三氧化二砷对其有去甲基化作用,使SFRP-1基因重新表达。三氧化二砷诱导前列腺癌PC-3凋亡可能与其去甲基化,使其重新表达有关。