溶菌酶广泛分布于不同生物体中,它通过破坏细菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4糖苷键,从而使其原有结构受到破坏造成菌体死亡。溶菌酶作为一种天然的蛋白质具有对人体无毒性,易吸收,不污染等特性。海参i-型溶菌酶基因由本实验室于2007年首次分离和鉴定,并已经将其目的蛋白分别在原核细胞和真核细胞中高效表达。进一步研究发现,该溶菌酶具有广谱抗菌活性。基因工程的最新进展是利用一些酵母细胞作为生物反应器,使高效表达外源基因成为可能,尤其是巴斯德毕赤酵母表达系统。毕赤酵母的醇氧化酶1(AOX1)基因的启动子具有强诱导性和强启动性,适合于外源基因的高水平诱导表达;毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏好性,可进行细胞高密度培养,有利于大规模工业化生产,因此使用毕赤酵母表达系统进行表达外源基因已成为目前的研究趋势。本课题的研究就是基于毕赤酵母的这些优点,从摇瓶到5L发酵罐、再到30L发酵罐的逐级放大,进行发酵生产海参i-型溶菌酶产品。本研究以实验室已构建重组的表达海参溶菌酶蛋白的毕赤酵母工程菌HS3-1为发酵出发菌株。首先,在摇瓶水平上对该毕赤酵母基因工程菌的发酵条件进行了优化,经验证确定了最佳发酵条件为培养基初始pH6.0,温度30℃,每24h向发酵液里添加终浓度为1.0%的甲醇,发酵时间96h。最后测定发酵液中海参溶菌酶的产量为5.12mg/L,进一步该发酵液经超滤浓缩后,使用镍离子亲和层析对目的蛋白进行纯化,其酶活力为868.57 U/mg。进一步使用5L发酵罐进行该基因工程菌株的发酵生产。使用的培养基为基础盐BSM培养基,发酵工艺参数为温度30℃,pH 6.0,搅拌转速800 r/min,溶解氧30%。发酵液培养约24h,补加甘油,继续培养至菌体湿重达约200 g/L,使发酵液中甘油耗尽。最后向发酵液补加甲醇1%进行产物诱导,继续发酵96h。分析得到发酵液酶产量为53.26 mg/L,经镍离子亲和层析纯化后得到海参溶菌酶精制产品,其酶活力为1238 U/mg。抑菌实验表明,该纯化的海参溶菌酶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌,革兰氏阴性菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌均具有显著的抑菌活性。在5L发酵罐的发酵基础上,进一步使用30L发酵罐进行该毕赤酵母基因工程菌株HS3-1的放大发酵生产。在发酵过程中由于发酵罐的空间增大,发酵罐能够承受一定罐压,所以能够减少泡沫的产生,减少了消泡剂的用量,有利于后期的分离纯化,并且30 L发酵要比5 L的发酵稳定受外界环境干扰较少。发酵培养基及发酵过程控制工艺与5L发酵罐相同,但对后处理的分离纯化工艺进行了改进。由于30L罐得到的发酵液量较大,故发酵液采用了高速管式离心机进行固液分离,并采用装有30 kD和5 kD的卷式超滤膜的膜设备对分离后的液体进行纯化,最后喷雾干燥得到海参溶菌酶产品,其酶活力为760.5 U/mg。通过本课题的研究,初步完成了利用毕赤酵母基因工程菌发酵生产海参溶菌酶的逐级放大研究,为后续的工业化发酵生产及表达产物的分离纯化提供了理论基础及工艺参数,为海参溶菌酶的应用奠定了基础。