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深度烧伤创面愈合后常伴随有增生性瘢痕形成,但是对参与增生性瘢痕发生发展的基因及其调控机制目前尚未完全清楚。我们曾经利用基因芯片技术筛选烧伤后早期增生性瘢痕组织与同体正常皮肤组织的差异表达基因研究,找出了97条相关基因。对这些相关基因利用生物信息学一一分析后发现Genebank ID hsu36189的代表基因p311在早期增生性瘢痕组织中呈显著的差异表达,而p311基因的表达在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中起着重要作用。那么,该基因的编码蛋白P311在纤维化形成、瘢痕发生发展过程中的作用是什么,其作用靶点是什么?这些问题鲜见文献报道。为此,我们结合蛋白组学研究内容与技术,利用酵母双杂交系统,以融合Gal4 DNA结合区(DNA binding domain, DBD)的P311为诱饵蛋白,筛选了成人肝cDNA文库,以期得到与P311相互作用蛋白的编码基因序列,为进一步的工作奠定基础。主要内容和研究结果如下:1.诱饵基因的验证p311经PCR扩增、纯化后连接至T载体pTZ57R/T,转化DH5α进行蓝白斑筛选阳性菌落并扩增、抽提质粒测序鉴定p311序列正确。2.诱饵重组质粒构建与转化以NdeⅠ?BamHⅠ同时双酶切p311 PCR产物和含BD结合域的质粒pGBKT7,回收产物并连接,转化DH5α通过抗性筛选获得阳性细菌克隆,对其进行扩增、提取质粒并利用PCR、酶切和测序鉴定pGBKT7-p311构建成功后,采取醋酸锂法转化感受态酵母菌株AH109,通过缺陷型培养基SD/-Trp筛选阳性克隆,并经PCR再次鉴定正确后保存菌种备用。3.文库筛选按照Clontech公司的操作手册通过酵母交配实验从预转的成人肝cDNA文库中筛选能够与P311相互作用的阳性克隆。筛选前以pGBKT7空载体作为对照质粒,完成pGBKT7-p311的毒性实验、自激活实验。然后将含有pGBKT7-p311的酵母菌株AH109与含有肝cDNA文库的酵母菌株Y187进行交配后在缺陷型培养基上逐步完成四轮筛选,共获取阳性克隆98个。对98个阳性克隆利用BD、AD载体引物进行PCR鉴定后,得到同时含有诱饵和文库序列的阳性克隆55个。最终从55个阳性克隆中成功提取出40个阳性文库质粒。经转化DH5α、抗性筛选、提取质粒并测序、分类整理后,确认所有阳性克隆均无自激活作用,并与pGBKT7-p311互换宿主