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目的:探讨何首乌饮调控DNA-RNA表观遗传串扰延缓“肾精亏虚”雄性大鼠睾丸组织和支持细胞衰老机制。方法:1“肾精亏虚”大鼠衰老模型建立及鉴定1.1使用电针疗仪以单因素电刺激法模拟“房劳”+“惊恐”构建“肾精亏虚”大鼠衰老模型。1.2结合睾丸组织β-半乳糖苷酶衰老染色、P16蛋白免疫组化,鉴定衰老模型。2测序数据生物信息学分析2.1甲基化芯片（MeDIP-chip）数据分析。使用Ringo,limma和MEDM,以青年组为对照,分别获取衰老组和何首乌饮组大鼠睾丸组织的差异甲基化基因。2.2 RNA测序（RNA-seq）测序数据分析。使用limma获取青年组、衰老组和何首乌饮组差异表达基因。2.3 RNA免疫沉淀后测序（MeRIP-seq）数据分析。使用exome Peak和cluster Profiler获取青年组、衰老组和何首乌饮组差异峰基因及其GO/KEGG信号通路分布及生物功能覆盖。3体内实验,验证测序数据分析结果3.1验证DNMT1受何首乌饮调控。RT-qPCR和Western Blot检测睾丸组织DNMT1表达改变情况。3.2验证MeDIP-chip及RNA-seq数据分析结论。RT-qPCR和Western Blot检测睾丸组织METTL3、FTO和IGF2BP1的表达情况。MSP检测Mettl3,Fto和Igf2bp1启动子区域甲基化情况。3.3验证MeRIP-seq数据分析结果。MeRIP-qPCR检测睾丸组织P53和P16RNA甲基化情况,RT-qPCR和Western Blot检测P53和P16表达。4大鼠睾丸支持细胞衰老模型建立及鉴定4.1芬顿试剂处理F3代睾丸支持细胞建立细胞衰老模型。通过β-Gal染色和流式细胞术检测细胞周期,鉴定细胞衰老模型。4.2慢病毒转染敲低支持细胞Dnmt1基因,RT-qPCR、Western Blot检测支持细胞中DNMT1表达水平,鉴定慢病毒敲低效率。5体外实验,机制探讨5.1β-Gal染色和流式细胞术检测细胞衰老及周期阻滞情况及DNMT1敲低后细胞衰老情况及何首乌饮含药血清的作用。5.2 MSP检测Mettl3、Fto和Igf2bp1启动子区域甲基化情况,及何首乌饮对其的影响。5.3 RT-qPCR、Western Blot检测METTL3、FTO和IGF2BP1 mRNA和蛋白表达情况及何首乌饮治疗后的作用,以及衰老相关基因P53和P16表达情况。5.4 MeRIP-qPCR检测衰老相关基因P53和P16 mRNA m6A修饰情况。结果:1大鼠衰老模型鉴定,相对于青年组,衰老组β-Gal阳性细胞率明显增加（P＜0.01）,P16 IHC评分升高（P＜0.05）,何首乌饮干预后,睾丸组织β-Gal阳性细胞率显著减少（P＜0.05）,P16 IHC评分降低（P＜0.05）。2对测序数据进行生物信息学分析2.1 MeDIP-chip数据分析,相较于青年组,在衰老组中Mettl3和Igf2bp1启动子区域甲基化程度低,Fto甲基化程度高,何首乌饮干预后Mettl3和Igf2bp1启动子区域甲基化程度升高,Fto甲基化程度降低。2.2 RNA-seq数据分析,相对与青年组,衰老组睾丸组织中,RNA甲基化基因METTL3和IGF2BP1表达上调,FTO表达下调。2.3 MeRIP-seq数据分析,以青年组为对照,获取衰老组差异甲基化峰基因并绘制火山图,可见差异甲基化RNA包含Tp53、Cdkn2a、Mtor和Becn1等。所得差异基因进行GO/KEGG分析,衰老组和何首乌饮组共同富集通路包含细胞周期、mRNA运输、mRNA稳定性、Wnt信号通路和m TOR信号通路。3体内实验,验证测序数据分析结果3.1睾丸组织DNMT1 RT-qPCR和Western Blot结果,相对青年组,衰老组DNMT1 mRNA和蛋白表达量明显下降（P＜0.001）,何首乌饮干预后,DNMT1 mRNA和蛋白表达量均有所回升（P＜0.05）。3.2睾丸组织METTL3、FTO和IGF2BP1 MSP结果,对比青年组,衰老组METTL3和IGF2BP1启动子区域甲基化程度明显降低（P＜0.001）,FTO甲基化升高（P＜0.001）,何首乌饮干预后METTL3和IGF2BP启动子区域甲基化增加（P＜0.05）,FTO甲基化下降（P＜0.05）。3.3睾丸组织METTL3、FTO和IGF2BP1 RT-qPCR和Western Blot结果,相较青年组,衰老组中METTL3和IGF2BP1 mRNA和蛋白表达量升高（P＜0.001）,FTO表达减少。何首乌饮干预后METTL3和IGF2BP1 mRNA和蛋白表达量降低,FTO表达增加（P＜0.01）。3.4睾丸组织P53、P16 MeRIP-qPCR、RT-qPCR和Western Blot结果,相对于青年组,衰老组睾丸组织P16和P53 mRNA m6A修饰明显增加（P＜0.01）,mRNA和蛋白表达量增加。何首乌饮干预后P16和P53 m6A修饰减少（P＜0.05）,两者mRNA和蛋白表达量降低。4睾丸支持细胞衰老模型鉴定4.1β-Gal染色和细胞周期检测结果,相较于对照组,衰老组蓝染阳性细胞比率增大,且细胞周期出现G1/S期阻滞（P＜0.01）。两者结合表明支持细胞衰老模型建立成功。何首乌饮含药血清作用后蓝染阳性细胞比率下降,G1/S期阻滞缓解（P＜0.05）。4.2睾丸支持细胞慢病毒转染结果,转染24h的GFP绿色荧光强度高,且RT-qPCR和Western Blot结果表明转染后DNMT1表达量明显下降（P＜0.05）。5体外实验,机制探讨5.1 DNMT1敲低睾丸支持细胞Mettl3、Fto和Igf2bp1 MSP结果,相较对照组,衰老组中METTL3和IGF2BP1启动子区域甲基化程度降低,FTO甲基化升高,何首乌饮含药血清处理后METTL3和IGF2BP1甲基化程度升高,FTO甲基化下降（P＜0.01）。相较于空载组,shDNMT1组中METTL3和IGF2BP1甲基化程度降低,FTO甲基化升高（P＜0.05）,shDNMT1+何首乌饮组中各基因甲基化程度未有明显改变。5.2 DNMT1敲低睾丸支持细胞METTL3、FTO和IGF2BP1 RT-qPCR和Western Blot结果,相对于对照组,衰老组中METTL3、IGF2BP1 mRNA表达量明显增加,FTO表达减少,何首乌饮组METTL3、IGF2BP1 mRNA表达量降低,FTO表达增加（P＜0.05）,蛋白表达趋势与mRNA表达趋势一致;相较于空载组,shDNMT1组METTL3、IGF2BP1和FTO mRNA和蛋白表达升高,shDNMT1+何首乌饮组METTL3、IGF2BP1和FTO mRNA及蛋白表达未发生明显改变。5.3 DNMT1敲低睾丸支持细胞P53、P16 MeRIP-qPCR结果,相较于对照组,P53、P16 mRNA m6A修饰程度在衰老组中均升高,且mRNA表达增加,何首乌饮组P53、P16 mRNA m6A修饰增加,mRNA表达下降（P＜0.05）;相较于空载组,shDNMT1组m6A修饰增加,mRNA表达增加（P＜0.05）。shDNMT1+何首乌饮组P53、P16 mRNA m6A修饰和mRNA表达无明显改变。结论:1何首乌饮可以降低Mettl3和Igf2bp1基因启动子区域甲基化,提升Fto基因启动子区域甲基化。2何首乌饮可以通过调节P53、P16 RNA甲基化水平延缓睾丸支持细胞衰老。3何首乌饮可通过影响Dnmt1、Metttl3、Fto和Igf2bp1的表达,参与DNA-RNA表观修饰串扰延缓“肾精亏虚”衰老大鼠睾丸支持细胞衰老。