背景和目的食管癌（Esophageal Cancer,EC）是一种发生在上消化道的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在世界范围内仍然高居不下。最新的全球癌症统计学数据显示,食管癌的发病率和死亡率分别位居全球肿瘤发病率和死亡率的第七位和第六位。食管癌分为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Cancer,ESCC）和食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma,EAC）,其中,ESCC占食管癌的90%以上,且在亚洲地区高发。近年来,医疗技术发展迅速,但食管鳞癌患者的预后无显著改善,5年生存率仍然只有15-25%。目前,除手术切除外,放化疗作为肿瘤治疗与预防术后复发的主要手段,但放化疗后副作用明显且化疗药长期服用易产生耐药。因此,食管癌的防治仍然是目前有待攻克的难题。肿瘤的发生发展是一个复杂的过程,除了癌基因与抑癌基因的异常调控参与肿瘤的发生发展,细胞的代谢异常也是肿瘤发生发展的一个重要原因。肿瘤细胞的代谢异常包括Warburg效应、脂肪酸和脂膜代谢旺盛、蛋白质和氨基酸代谢呈负氮平衡等。其中,Warburg效应是恶性肿瘤细胞糖代谢的显著特征,肿瘤细胞以糖酵解方式获取能量（糖酵解产生的丙酮酸进入线粒体,进而在丙酮酸脱氢酶的作用下,生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环产生ATP）,其快速增殖往往需要消耗大量的葡萄糖来产生ATP。线粒体作为细胞内制造能量的场所,参与糖酵解产生能量的过程,并调节多种细胞功能,包括能量的调节、氧化还原状态的调节、活性氧的产生以及细胞内钙水平的控制等。这些细胞功能的变化会影响生物合成途径、细胞信号转导途径以及转录因子的调控作用等。近年来,越来越多的证据显示,线粒体与肿瘤的发生发展密切相关。线粒体相关基因的突变会影响线粒体代谢过程,例如琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）的突变、延胡索酸水合酶（Fumarate hydratase,FH）的突变等,均可导致肿瘤的发生。自噬,是一个细胞内溶酶体的降解和蛋白质、细胞器循环的过程。一方面,自噬可以通过抑制氧化应激、慢性组织损伤以及致癌信号通路,从而抑制肿瘤的发生;另一方面,自噬通过介导细胞内容物的循环回收,来维持线粒体的正常功能和能量产生,反而有利于肿瘤细胞的生存。因此,线粒体自噬的调节为肿瘤的治疗提供了一个新的策略。近年来,研究数据显示,美国食品药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的一些非抗癌药物像二甲双胍、他汀类等表现出了一定程度的抗肿瘤作用。这些非抗癌药的安全性较高,且相比于新药的研发到上市这一漫长过程,将它们用于肿瘤的治疗能够节省了大量的成本和时间,因此,老药新用为食管鳞癌的防治提供了新的策略。在本课题组的研究中,从购买的一批FDA批准的非抗癌药中筛选对食管鳞癌细胞的克隆形成有抑制作用的药物,筛选出了甲氟喹（Mefloquine,MQ）,它是一种临床上用于治疗耐氯喹或多药耐药的恶性疟的药物,有研究发现,MQ已经在肝癌、结肠癌等中表现出了一定的抗肿瘤作用,但其在食管癌中的作用及机制尚不清楚。方法（1）研究甲氟喹在体外对食管鳞癌细胞的作用首先,选用永生化的正常食管上皮细胞（Shantou human embryonic esophageal cells,SHEE cells）,检测甲氟喹对SHEE细胞的毒性作用;接着,利用细胞增殖和克隆形成实验,检测甲氟喹对食管鳞癌细胞的增殖抑制作用。（2）采用蛋白质组学探索甲氟喹的抑癌机制选用食管鳞癌的细胞系KYSE150细胞,甲氟喹（10 μM）处理细胞24h后送样。质谱分析及数据库搜索筛选出来甲氟喹处理组与对照组之间的差异蛋白;接着,通过对差异蛋白进行亚细胞定位分析（Sub-cellular Localization）、基因本体术语富集分析（Gene Oncology）、KEGG通路富集分析及韦恩分析等,找到甲氟喹作用后影响最明显的细胞器、富集到的信号通路及分子。（3）利用相关试剂盒检测线粒体功能的改变利用活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）检测试剂盒检测甲氟喹作用后,食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE450中ROS的产生情况;利用Western blot检测甲氟喹作用后,KYSE150 和 KYSE450 细胞中氧化磷酸化复合物（Oxidative phosphorylation complex,OXPHOS complex）的蛋白变化水平;利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）检测试剂盒检测甲氟喹作用后,KYSE150和KYSE450细胞中NAD+/NADH的值的变化;利用ATP（Adenosine triphosphate,ATP）检测试剂盒检测甲氟喹作用后,KYSE150和KYSE450细胞中ATP的产量;利用染料N-吖啶橙（N-acridine orange,NAO）检测甲氟喹处理后,KYSE150和KYSE450细胞中线粒体的完整性;利用透射电镜观察甲氟喹作用后线粒体的形态改变,同时统计平均每个视野中自噬线粒体的个数;利用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测甲氟喹作用后,线粒体自噬相关标记物（Light chain 3,LC3）的改变,以及检测线粒体标记物（Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,MTCO1）和自噬标记物LC3的共定位情况;利用Western blot检测LC3的蛋白水平变化情况;同时,利用细胞凋亡实验检测甲氟喹作用后,是否会引起KYSE150和KYSE450细胞发生凋亡。（4）研究SDHC在食管鳞癌中的作用首先,利用TCGA数据库分析蛋白质组学数据富集到的4个分子,琥珀酸脱氢酶复合物 C 亚单位（Succinate dehydrogenase complex C subunit,SDHC）、琥珀酸脱氢酶复合物 D亚单位（Succinate dehydrogenase complex D subunit,SDHD）、线粒体编码的细胞色素 c 氧化酶Ⅲ（Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅲ,MTC03）和还原型辅酶 Ⅰ:泛醌氧化还原酶 V3 亚单位（Reduced coenzyme Ⅰ:ubiquinone oxidoreductase V3 subunit,NDUFV3）在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况;接着,利用Western blot检测甲氟喹作用后,KYSE150和SHEE细胞中 SDHC的蛋白水平;再接着,利用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测SDHC在肿瘤组织与癌旁组织中的表达情况;最后,利用shRNA构建SDHC敲低的KYSE150和KYSE450细胞株,并利用细胞增殖实验和克隆形成实验检测SDHC敲低后,细胞的增殖能力和克隆形成能力的改变。（5）研究甲氟喹的体内抗癌效果首先,利用Western blot检测构建好的食管鳞癌移植瘤（Patient-derived Xenograft）模型组织中SDHC的表达情况,选出两例SDHC高表达和两例SDHC低表达的移植瘤模型;将这4例移植瘤模型稳定传代后分组,分别灌胃给予溶剂对照（灭菌水）、低剂量（50 mg/kg）和高剂量（200 mg/kg）的甲氟喹,来研究甲氟喹对移植瘤生长的抑制作用;接着,利用IHC检测不同处理组的组织中SDHC的表达情况。结果（1）甲氟喹可以抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成细胞毒性实验结果显示,甲氟喹处理细胞后,对SHEE细胞没有表现出明显的毒性作用;细胞增殖实验和克隆形成实验结果显示,甲氟喹可以显著抑制KYSE150和KYSE450细胞的增殖能力和克隆形成能力,且具有时间和剂量的依赖性。（2）线粒体可能在甲氟喹的抗癌作用中发挥一定的作用通过质谱和生物信息学分析,共鉴定到6167个蛋白质,其中5151个蛋白有定量信息,以1.5倍为变化阈值,t-test p-value＜0.05为标准,共筛选出147个差异蛋白,其中86个蛋白上调,61个蛋白下调;同时,质谱质控检测结果显示样品制备符合要求;热图展示甲氟喹处理组和对照组之间差异蛋白的表达情况,本实验选用下调的差异蛋白进行研究;WoLF PSORT软件预测结果显示差异蛋白主要分布在脂膜和线粒体;GO注释分析结果显示富集到的排名前3位的细胞成分包括细胞器膜、线粒体膜和线粒体;KEGG通路富集分析结果显示富集到的下调最明显的5条信号通路,包括阿尔兹海默病、非酒精性脂肪肝、帕金森病、氧化磷酸化和亨廷顿病相关的信号通路,均与线粒体功能相关;韦恩图分析结果显示富集到的5条信号通路中有4个共有的线粒体蛋白,包括琥珀酸脱氢酶复合物C亚单位（SDHC）、琥珀酸脱氢酶复合物D亚单位（SDHD）、线粒体编码的细胞色素c氧化酶Ⅲ（MTC03）和还原型辅酶Ⅰ:泛醌氧化还原酶V3亚单位（NDUFV3）。（3）甲氟喹处理食管鳞癌细胞后,线粒体的功能受到影响ROS试剂盒检测结果显示,甲氟喹处理后,KYSE150和KYSE450细胞中ROS的产量明显增加;Western blot结果显示,甲氟喹处理后,KYSE150和KYSE450细胞中OXPHOS复合物的蛋白水平明显降低;NAD+/NADH试剂盒检测结果显示,甲氟喹处理后,KYSE150和KYSE450细胞中NAD+/NADH的值明显降低;ATP试剂盒检测结果显示,甲氟喹作用后,KYSE150和KYSE450细胞中ATP的产量明显减少;NAO染色结果表明,甲氟喹作用后,KYSE150和KYSE450细胞中NAO的着色明显减少;透射电镜结果显示,甲氟喹作用后,KYSE150细胞中线粒体出现双层膜的自噬样小泡,且平均每个视野中出现自噬样改变的线粒体个数明显增加;同时,IF结果显示,甲氟喹作用后,自噬标记物LC3的荧光信号明显增强,且LC3与线粒体的标记物MTCO1出现明显的共定位情况;最后,Western blot结果显示,甲氟喹作用后,LC3-II的蛋白表达水平明显增加;凋亡实验结果显示,甲氟喹处理细胞后,不会引起细胞发生凋亡。（4）SDHC在食管鳞癌的进展中发挥促癌的作用TCGA数据库分析结果显示,与癌旁组织相比,SDHC在食管腺癌和食管鳞癌组织中均显著高表达,但SDHD和NDUFV3在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达并没有明显差异,MTC03在食管鳞癌组织中的表达没有报道;Western blot结果显示,甲氟喹（10 μM）处理KYSE150细胞24 h后,SDHC的蛋白水平明显下降;同时,甲氟喹（10 μM）处理SHEE细胞24h后,SDHC的蛋白水平没有明显变化;免疫组化结果显示,在食管鳞癌组织芯片中,癌组织中SDHC的表达水平明显高于癌旁组织;细胞增殖和克隆形成实验结果显示,在KYSE150和KYSE450细胞中敲低SDHC后,细胞的增殖和克隆形成能力受到明显抑制。（5）甲氟喹在体内抑制食管鳞癌移植瘤的生长Western blot结果显示,在EG59和EG60中,SDHC的蛋白表达水平较高,在EG2,EG20,EG37和EG84移植瘤组织中的蛋白表达水平较低,而SDHD,MTC03和NDUFV3在这些移植瘤组织中的表达并没有明显的变化;体内实验结果显示,甲氟喹可以显著抑制EG59和EG60移植瘤的生长,而对EG20和EG84移植瘤的生长没有表现出抑制作用;IHC结果显示,在EG59和EG60中,甲氟喹处理组的移植瘤组织中SDHC的表达水平明显降低,而在EG20和EG84中,甲氟喹处理组和对照组中SDHC的表达水平没有明显差异。结论（1）甲氟喹可以在体内外抑制食管鳞癌的增殖。（2）甲氟喹可以影响线粒体的功能及诱导线粒体发生自噬,同时不会引起细胞发生凋亡。（3）SDHC在甲氟喹的抗癌作用中扮演了重要的角色,提示其具有作为肿瘤治疗新靶点的潜力。