论文部分内容阅读
1.背景与目的类固醇激素（Steroidhormones,SHs）是脊椎动物体内自主分泌的小分子脂溶性甾体化合物。依据其功能,可以分为雄激素、雌激素、孕激素和皮质激素。体内SHs水平与多种生理或心理疾病密切相关,其准确、灵敏、快速的分析测定方法对于相关疾病的诊断和药物治疗效果的评价十分重要。而目前临床上主要采用酶联免疫反应法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,其灵敏度和特异性难以满足现代医学要求。临床上主要采用激素甾体合成药物对内分泌紊乱所致的疾病进行治疗,其具有异性化和肾毒性等副作用,不适合长期给药。综上所述,本课题采用了超高效液相色谱-质谱技术（Ultra-performanceliquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS/MS）,研究了类固醇代谢通路中的 18种SHs在细胞培养液、大鼠血清和人体尿液生物样品中的定量分析方法,并应用于三七中皂苷类成分类固醇激素样作用的评价研究。该研究为后期的临床检测SHs提供更加便利的条件,为三七的皂苷类化合物的新药效筛查提供一定的实验基础。2.方法生物样品中类固醇激素UPLC-MS/MS分析方法的研究建立:基于课题组前期建立的方法,在细胞培养液生物样品中分别从SHs分析方法的质谱条件、样品制备、色谱条件采取进一步的优化。在质谱条件考察中,采用针泵恒流进样方式对18种SHs的MRM模式下的母离子、子离子等相关参数进行考察。在样品前处理方法考察中,考察沉淀蛋白法中乙腈与异丙醇沉淀剂提取效果、固相萃取法中乙酸乙酯与丙酮洗脱剂提取效果,液液萃取法中乙酸乙酯萃取剂的萃取次数和萃取剂剂量各因素对细胞培养液中SHs的提取效果。在该分析方法的色谱条件考察中,主要考察液相方法中的流动相溶液。此外,在细胞培养液为生物载体中,我们对该分析方法进行方法学考察。此外,在大鼠血清样品中,通过空白血清样品进行方法学考察。在人体尿液中,通过前处理优化后也对该方法学进行相应的考察。基于UPLC-MS/MS分析的三七皂苷类固醇激素样作用评价研究:运用已建立的方法,通过对过表达5α还原酶S1型293T工具细胞的培养,给药24h后评价研究原人参二醇（Protopanaxadiol,PPD）、三七根茎总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg2、人参皂苷Ro、三七皂苷R1、三七皂苷R2对过表达5α-还原酶S1型细胞培养液中SHs水平的影响。在S2型细胞中,给药24h后评价研究人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb3和三七皂苷R1对细胞上清液中SHs水平的影响。在雌激素依赖性MCF-7细胞中,主要评价人参皂苷Rg2在12 h-72 h的给药反应时间下对MCF-7细胞上清液中SHs的影响。在体内实验中,建立摘除大鼠睾丸去势手术和皮下注射丙酸睾酮致使的大鼠前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia,BPH）模型,SD雄性大鼠分为4组,分别为假手术组、模型组、阳性药组和PNS给药组,经过4周的给药时间,在最后一次给药后进行大鼠的腹主动脉取血和前列腺脏器剪取,从而考察大鼠的前列腺脏器系数、前列腺病理切片和大鼠血清中SHs水平,评价PNS对前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia,BPH）模型雄性去势大鼠中SHs的影响。3.结果生物样品中类固醇激素UPLC-MS/MS分析方法的研究建立:UPLC-MS/MS分析方法中采用多反应监测（Multiple reaction monitoring,MRM）模式、电喷雾电离（Electrospray ionization,ESI）方式的 UPLC-MS/MS 方法,建立了细胞培养液、大鼠血清和人体尿液生物样品中18种SHs的快速定量分析方法。结果表明,在直接五倍量乙酸乙酯（Ethyl acetate,EtOAc）液液萃取的前处理方法下,孕酮（Progesterone,P）、睾酮（Testosterone,T）、皮质醇（Cortisol,C）等 14 种 SHs在正离子模式下测定分析,以氘代睾酮（Testosterone-d3,T-d3）为内标化合物,0.5 mM的醋酸铵水溶液-乙腈为流动相溶液,14种分析物能够在6分钟内完成高通量测定。以氘代雌二醇（Estradiol-d3,E2-d3）为内标化合物,0.2mM的氟化铵水溶液-甲醇为流动相溶液,雌酮（Estrone,E1）、醛固酮（Aldosterone,ALD）等4种SHs在负离子模式下进行分析。在人体尿液样品的前处理优化中,采用酶水解法对尿样中类固醇激素-葡萄糖醛酸缀合物进行水解,从而实现了同时测定尿液中游离和结合形式的SHs水平的可能,大大提升了尿液中SHs实际水平的可测性。通过生物样品细胞培养液、大鼠血清和人体尿液方法学的考察,结果显示,不同生物样品中的基质不影响该方法对SHs的测定,且在该方法下的提取回收率均高于82%。18种分析物的线性范围在5 pg/mL-100ng/mL以内,化合物线性良好,相关系数均大于0.99。SHs的最低定量限（Lower limit of quantitation,LLOQ）在5 pg/mL-1000 pg/mL 范围内,其中孕酮、11-去氧皮质醇（11-deoxycortisol,11-DC）、睾酮和雌酮的LLOQ可达到5 pg/mL。基于UPLC-MS/MS分析的三七皂苷类固醇激素样作用评价研究:在雄激素依赖性的过表达5α-还原酶S1型293T细胞的细胞培养液中,PPD组、人参皂苷Rg2组、PNS组、人参皂苷Ro和三七皂苷R1组相较空白组均能够显著提高睾酮和雄烯二醇（Androstenediol,AD-L）的含量,其具有统计学意义。在过表达5α-还原酶S2型293T细胞中,人参皂苷Rg2组细胞培养液中的脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone,DHEA）和雄烯二酮（Androstenedione,AD）的含量与对照组相比,有显著性上升趋势（P＜0.001或P＜0.05）。在雌激素依赖性的乳腺癌MCF-7细胞培养液中,人参皂苷Rg2组中的睾酮水平较空白组和阳性对照组中具有显著的提高（P＜0.001）,且在24 h达到最高点。体外实验结果表明,人参皂苷Rg2具有明显的类固醇激素样作用,对SHs之间的转化有较显著的影响。在体内实验中,建立摘除大鼠双侧睾丸手术与皮下注射丙酸睾酮致使的BPH雄性去势大鼠模型,探究PNS对大鼠体内SHs的影响。通过前列腺器官的脏器系数和前列腺组织的病理切片观测,结果表明PNS能够减轻BPH大鼠的前列腺的脏器系数,缓解大鼠的前列腺组织病变症状。此外,通过UPLC-MS/MS对大鼠血清中SHs的含量检测,可得PNS显著升高了血清中睾酮和雄烯二酮的含量（P＜0.01或P＜0.05）,显著降低血清中二氢睾酮的水平（P＜0.001）,提升了血清中皮质醇和可的松（Cortisone,C-sone）的浓度（P＜0.01或P＜0.01）,进一步证实了 PNS具有一定的雄性激素和皮质激素样作用。4.结论本课题建立的UPLC-MS/MS分析方法可以保证在不同生物样品中18种SHs的快速高通量定量分析,从而为后期的临床检测SHs提供更加便利的条件。运用建立的方法,采用5α-还原酶S1型工具细胞、5α-还原酶S1型工具细胞和乳腺癌MCF-7细胞,对皂苷化合物的雄激素、雌激素样作用进行了初步评价,发现原人参二醇（PPD）、人参皂苷Rg2具有5α-还原酶抑制作用;进一步采用摘除大鼠双侧睾丸手术和皮下注射丙酸睾酮诱导方法建立雄性大鼠去势模型,对三七总皂苷抑制大鼠前列腺增生作用进行了研究。结果表明三七总皂苷通过抑制5α-还原酶而调控睾酮与二氢睾酮的水平,从而缓解大鼠前列腺增生病变症状。该研究为三七中的皂苷类化合物的新药效筛查提供一定的实验基础,进而为中药化合物的类固醇激素样作用的药效评价提供一定研究思路。