聚赖氨酸标记量子点荧光探针制备工艺及对乳制品沙门氏菌的检测应用

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沙门氏菌是一种对人体健康有巨大威胁的食源性致病菌,也是乳制品中常见的食源性病原体之一。它对人类健康和安全的影响大于其它食源性病原体。由于沙门氏菌的高传染性以及高致病率的特性,以及现有的沙门氏菌检测方法有着费时费力、操作繁琐以及检测成本高等缺点,因此,建立一种新型、快速、方便的食源性致病菌检测方法对于保证食品安全是很有必要的。本文研究了一种基于量子点(CdSe/ZnS QD)的沙门氏菌新型检测方法。建立了一种基于链霉亲和素(SA)生物素(Bio)体系和线性长链聚合物聚赖氨酸(PLL)的多重荧光生物传感器应用于牛奶中沙门氏菌的检测方法。主要研究内容如下:首先研究了荧光免疫传感器中荧光探针的制备工艺及其表征。重点研究了该传感器探针-高稳定性能的信号源(SA修饰的CdSe/ZnS QD纳米粒子)的合成方法。研究结果的水化粒径数据显示,原始的CdSe/ZnS QD的水化粒径为15nm,采用EDC/NHSS方法修饰CdSe/ZnS QD后,CdSe/ZnS QD-SA的水化粒径增加到25nm。由TEM可知CdSe/ZnS QD-SA粒径分布均匀,无团聚现象。此外,荧光光谱分析结果表明,CdSe/ZnS QD-SA与原始CdSe/ZnS QD相比,光学性质无明显变化。同时琼脂糖凝胶电泳表征显示,CdSe/ZnS QD-SA与未修饰的CdSe/ZnS QD相比在迁移距离、迁移速度都有明显改变。这些表征结果表明SA成功偶联在量子点上,说明了荧光探针的合成成功。其次,利用合成好的探针构建检测系统,建立了一种基于链霉亲和素(SA)生物素(Bio)体系和线性聚合物PLL的多重荧光生物传感器检测牛奶中的沙门氏菌的方法,并进行了检测方法学评估。首先,沙门氏菌被捕获在一个96孔的黑色板上,与配对的沙门氏菌单抗形成一个双抗夹心结构。其次,利用SA-Bio特异性将SA固定在生物素化抗体(BT-m Ab)上。然后,生物素修饰聚赖氨酸(BT-PLL)与SA通过SA-Bio体系再次特异性结合达到信号放大的目的。最后,将水溶性CdSe/ZnS QD标记的SA加入到黑色96孔板上,与BT-PLL进行共价偶联。通过SA与生物素的层层重叠和生物素化PLL的共价偶联,测定96孔板中甩干的荧光免疫复合物的荧光信号检测目标菌。通过优化检测系统的主要实验参数,检测系统工艺达到最佳效果,其最佳工艺参数为:CdSe/ZnS QD-SA的合成摩尔比为1:20、生物素化抗体用量2.5μg/m L、SA用量5μg/m L、BT-PLL的用量为17.5μg/m L、探针孵育时间为30 min。在最佳实验工艺参数下,该荧光免疫传感器对PBS缓冲液中沙门氏菌的检测限为4.9×10~3CFU/m L。在牛乳中的检测限为4.9×10~4CFU/m L,同时在牛乳中的加标回收率为84%-114%,RSD为6.55%-9.28%。因此该传感器对牛乳样品中沙门氏菌的检测具有良好的适用性。此外,该荧光传感器检测时间短、特异性良好,可在1.5 h内完成对实际样品中沙门氏菌的检测。因此,本研究建立的新型检测平台可应用于实际样品中食源性致病菌的快速检测。
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