鲫鱼温和气单胞菌的分离鉴定与生物学特性分析

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鲫鱼是我国目前养殖的主要淡水鱼之一,在我国绝大多数省、直辖市以及自治区都有一定养殖量,为辐鳍鱼纲(拉丁学名)、鲤形目、鲤科、鲫属的一种鱼类。随着科学技术的不断发展,现代鲫鱼养殖规模越来越大,集约化程度越来越高,养殖量相当巨大。养殖量比较大的几个地区是:江苏、江西、湖北,全国年均产量已经超过100万吨。随着养殖量的不断增加,鲫鱼受到不同种类疾病的困扰越来越多,大规模的病害现象越来越频繁。温和气单胞菌(Aeromonas sobria)属弧菌科、气单胞菌属,其在自然界中广泛存在,是一种常见的人—兽—鱼共患条件致病菌,可以导致人患各种疾病,也已明确是很多水产养殖动物的病原菌。2018年,安徽省淮南市某养殖场品种为中科3号的鲫鱼出现大量死亡现象,外观检查发现患病鱼体表有1个或者多个疥疮样病灶,疥疮处鳞片松动或脱落,并有渗血现象,疥疮内部肌肉已溶解并化脓。解剖发现腹腔内有大量液体,肝脏有充血现象。从病鱼的疥疮和肝脏取样,在固体培养基上分离纯化后得到四个优势菌株,分别命名为AHWH-1、AHWH-2、AHWH-3、AHWH-4。通过对纯化菌株进行革兰氏染色、氧化酶试验、菌落形态观察、生理生化鉴定,判定所纯化的菌株属于气单胞菌属细菌。接着对四个菌株的16S r RNA进行PCR扩增,对目的条带进行纯化回收后送测序。所得的测序结果在NCBI中进行同源性搜索,通过多重序列比对以及系统发育树分析,结果显示四个菌株均为温和气单胞菌,因此选择AHWH-1菌株进行后续试验。采用常规PCR的方法,对AHWH-1菌株进行十种气单胞菌主要毒力基因检测,结果显示:AHWH-1菌株含有气溶素(Aer)、细胞毒性肠毒素(Act)、酯酶(Lip)、鞭毛(Fla)、弹性蛋白酶(ahy B)、溶血素(hly A)、热不稳定性肠毒素(Alt)七种毒力基因,不含有热稳定性肠毒素(Ast)、核酶(Exu)和丝氨酸蛋白酶(Ser)。研究AHWH-1菌株在不同的温度和p H条件培养基中的生长情况。研究结果表明:AHWH-1菌株在所选的15~40℃范围内均能生长,生长最快的温度为30℃。在PH为4~10的范围内均能生长,小于4或大于10基本不生长,生长最适p H为7.0。通过药敏纸片法检测AHWH-1菌株对13种常见抗生素的体外敏感性,结果显示:AHWH-1菌株对庆大霉素、新霉素、四环素、恩诺沙星、诺氟沙星、复方新诺明、卡那霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、氧氟沙星、多西环素、甲氧苄氨嘧啶敏感,对氨苄西林耐药。人工感染试验表明该菌的LD50为1.0×107CFU/ml。
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