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复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指妊娠早期连续三次(包括三次)以上的自然流产[1]，其发生率在育龄女性群体中是2％-5％左右，占所有女性发生自然流产的15％-20％，是妊娠前3个月内最常见的异常情况之一[2]。这种流产的原因非常复杂，除最常见的遗传因素(染色体异常)、内分泌异常如甲状腺功能问题等、免疫因素(抗心磷脂综合征或自身免疫病等)、感染性疾病、及血管栓塞性疾病[3-6]等之外，还有大约一半患者流产的病因不明，连续发生三次(包括三次)以上的称不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。 URSA的病因及发病机制复杂多样，目前临床上还没有明确的预测反复流产的指标和有效提高治疗成功率、预防自然流产再次发生的方法，所以在新的研究领域寻求复发性流产可能的发病机制是医学发展所需求的，也是生殖领域的研究热点之一。 目前LRH-1及其相关基因与人类URSA的发生是否存在相关性，国内外罕见报告。 印记基因p57Kip2在葡萄胎及人类辅助生殖技术后代中的相关研究均见报告，但与URSA的有关研究，尚需完善。 本文研究URSA患者绒毛与蜕膜组织中LRH-1、绒毛中p57Kip2及各自相关基因水平表达的变化情况，从单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、启动子区甲基化状态等多方面探讨LRH-1、 p57Kip2与URSA的关系，有助于揭示LRH-1、p57Kip2与人类生殖的关系，为URSA发病机制的研究提供一定的参考作用。 第一部分 不明原因复发性流产患者绒毛与蜕膜中LRH-1的表达 目的： 对比分析URSA患者与正常妊娠者绒毛及蜕膜组织中LRH-1基因表达水平的差异情况，分析其表达差异和CYP19、P450 scc表达情况，具体分析LRH-1基因表达变化和原因不明复发性流产的关系。 方法： 选择30例从2015年8月到2016年9月在青岛大学附属威海市立二院接受治疗的URSA患者再次胚胎停育的绒毛及蜕膜组织进行研究，同时选择了30例计划外妊娠患者人工流产的绒毛及蜕膜组织进行对比分析，分别设置为实验组(URSA组)和对照组，通过免疫组化技术对两组的绒毛及蜕膜组织LRH-1基因的表达水平进行检测，RT-PCR及Western-blot法分别检测两组LRH-1、 CYP19、 P450scc基因mRNA及蛋白表达变化。 结果： 1.免疫组化检测显示:LRH-1蛋白在两组的绒毛及蜕膜中均有表达。其在URSA组绒毛中的表达水平明显低于对照组(p＜0.05)，但在两组蜕膜中的表达量差异无统计学意义(p＞0.05)。 2.RT-PCR检测显示:在绒毛中，URSA组LRH-1 mRNA含量明显低于对照组(p＜0.05);在蜕膜中，URSA组LRH-1 mRNA含量和对照组相比差异无统计学意义(p＞0.05);CYP19及P450scc mRNA表达水平与LRH-1在绒毛与蜕膜中的表达变化一致。 3.Western-blot检测显示:在绒毛中，URSA组LRH-1蛋白表达量明显低于对照组(p＜0.05);在蜕膜中，两组LRH-1蛋白表达量差异无统计学意义(p＞0.05);CYP19、P450scc蛋白表达水平与LRH-1在绒毛与蜕膜中的表达变化一致。 结论： 1.URSA组绒毛中LRH-1表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。而在蜕膜组织中的两组表达量无明显差异(p＞0.05)。提示LRH-1在绒毛组织中表达水平降低可能与URSA有关。 2.绒毛中CYP19及P450scc的表达水平在两组中差异有统计学意义，URSA组明显低于对照组(p＜0.05)。而在蜕膜组织中的两组表达量无明显差异(p＞0.05)。提示C YP19及P450scc在绒毛组织中表达水平降低也可能与URSA有关。 第二部分 LRH-1基因单核苷酸多态性与不明原因复发性流产的相关性研究 目的： 探讨LRH-1基因rs2816948、CYP19基因rs727479和rs700518、P450scc基因rs4077582位点单核苷酸多态性与URSA的相关性。 方法： 选择82例URSA和97例正常妊娠妇女进行对照研究，以人工流产时的绒毛组织为样本，并提取绒毛基因组DNA，利用直接测序法对上述位点进行检测，用统计学方法分析单核苷酸多态性与URSA的关系。 结果： URSA组研究对象CYP19基因的rs727479位点GG基因型、G等位基因的分布频率高于正常对照组女性，差异有统计学意义(p＜0.05);但两组LRH-1基因rs2816948位点、CYP19基因rs700518位点基因型及等位基因分布无统计学差异(p＞0.05);与URSA组P450 scc基因rs4077582位点CC基因型频率较正常对照组低，差异有统计学意义(p＜0.05)，而其等位基因的分布在两组间差异无统计学意义(p＞0.05)。 结论： 1.URSA患者CYP19基因的rs727479位点(单核苷酸多态性)GG基因型、G等位基因频率高于正常对照组女性(p＜0.05)，而P450 scc基因rs4077582位点CC基因型频率低于正常对照组女性(p＜0.05)。 2.LRH-1基因rs2816948位点、CYP19基因rs700518位点的基因型及等位基因分布在URSA组及对照组相比无明显差异。 第三部分 印迹基因p57Kip2在不明原因复发性流产患者绒毛中的表达研究 目的： 检测URSA组与对照组孕妇绒毛中p57Kip2基因的表达，深入分析p57Kip2基因表达和URSA的关系。 方法： 82例早期妊娠的不明原因复发性流产患者(URSA组)及82例正常妊娠者(对照组)，取绒毛，早期自然流产绒毛分为孕7-9周样本及孕10-12周样本两组，免疫组化检测绒毛组织p57Kip2表达变化，RT-PCR及Western-blot方法分别检测p57Kip2基因mRNA及蛋白表达。 结果： 1.免疫组化检测显示:p57Kip2基因在孕10-12周样本URSA组的绒毛中表达更高，和对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05)，而在孕7-9周样本URSA组的绒毛中表达水平与正常妊娠组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。 2.RT-PCR检测显示:p57Kip2基因在URSA组绒毛孕10-12周样本中的表达水平高于正常组，差异有统计学意义(p＜0.05)。在孕7-9周样本中两组的此基因表达水平差异无统计学意义(p＞0.05)。 3.Western-blot检测显示:p57Kip2基因在URSA组孕10-12周绒毛中的表达水平高于同样条件下正常早孕组的，差异有统计学意义(p＜0.05)。而URSA组绒毛孕7-9周样本中p57Kip2基因表达与相同孕周的正常早孕差异无统计学意义(p＞0.05)。 结论： 1.孕10-12周标本中，URSA患者绒毛p57Kip2基因的表达水平显著高于正常妊娠组(p＜0.05)。提示URSA患者10-12周胚胎停育绒毛组织中p57Kip存在高表达。 2.孕7-9周标本中，URSA患者绒毛p57Kip2基因的表达与正常妊娠无明显差异(p＞0.05)。 第四部分 不明原因复发性流产患者印记基因p57Kip2启动子区的DNA甲基化状态研究 目的： 探讨印迹基因p57Kip2启动子区的DNA甲基化状态和URSA之间的相关性。 方法： 选择第三部分中URSA组与对照组孕10-12周的绒毛组织各30例，提取所有标本基因组DNA，然后进行p57Kip2、NOEY2、PEG3基因启动子区的DNA甲基化测序，且进行对比分析，在统计分析基础上研究基因启动子区DNA甲基化状态与URSA的相关性。 结果： URSA组的p57Kip2基因启动子区有两个位点(位点6、位点7)的甲基化水平低于对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)，而两组间此基因启动子区其余位点以及相关印记基因NOEY2、PEG3启动子区数个位点的DNA甲基化状态差异无统计学意义(p＞0.05)。 结论： 1.p57Kip2基因启动子区两个位点的甲基化水平在两组中存在差异，URSA患者这两个位点的甲基化水平明显低于对照组。 2.p57Kip2基因启动子区其余位点以及NOEY2、PEG3启动子区的DNA甲基化状态在两组间无明显差异。