对细菌基因的敲除与回补可以用于基因功能的研究和基因组的改造。噬菌体的Red重组系统因其能够促进电穿孔引入的外源核酸序列与细菌基因组之间的重组,而被广泛应用于基因工程。在同源重组的过程中,通常需要一个或多个选择步骤来筛选重组体,选择步骤可以通过抗生素耐药性基因、反选择标记基因或者一些报告基因等来实现。传统的Red同源重组敲除系统依赖于抗性标记基因的正向选择,但此方法无法实现基因回补菌株的筛选,不利于基因功能的相关研究。在特定的条件下,反选择标记基因会导致细胞死亡,利用该特性可以达到反向筛选转化子的目的。sacB和tet A基因产物分别对蔗糖和镰刀菌酸敏感,因此这两个基因均可以作为反选择标记。将Red同源重组技术与正反选择标记基因结合,可以实现细菌基因的敲除与回补。本研究对大肠杆菌MG1655的lacZ基因进行敲除与回补,探究双重选择系统的可行性与有效性。研究结果表明,使用sacB-CmR片段敲除lacZ基因,利用氯霉素抗性成功筛选到突变株MG1655ΔlacZ::sacB-CmR。但仅有一种反选择标记基因sacB存在时,在蔗糖平板上难以筛选到lacZ基因的回补菌株。因此进一步构建了选择作用更强的双重选择系统。通过氨基酸序列比对,表明质粒p DNR-LIB上的反选择标记基因,与枯草芽孢杆菌中的sacB基因高度同源。将p DNR-LIB上的sacB基因克隆到质粒p AH162上,构建了含有tet A-sacB双基因盒的重组质粒p AH162-sacB,该双基因盒具有正反选择作用。在敲除大肠杆菌MG1655中的lacZ基因时,利用双重选择系统中tet A基因表达的四环素抗性成功筛选到阳性菌株MG1655ΔlacZ::tet A-sacB。为了达到较好的反选择效果,对Tet A/SacB反选择培养基中的镰刀菌酸浓度和蔗糖浓度进行了探究,在蔗糖浓度为6%、镰刀菌酸浓度为24μg/m L时,可以抑制携带tet A-sacB基因盒的细菌的生长,达到反向筛选的目的。利用双重选择系统的反向选择作用,在Tet A/SacB反选择培养基上进行筛选,实现了lacZ基因的回补。最后利用β-半乳糖苷酶活性分析进一步验证了基因敲除与基因回补结果的可靠性。综上所述,本研究构建的双重选择系统具有独特优势,结合Red同源重组技术,可以用于细菌基因敲除与基因回补研究中正反选择阳性转化子。而且此选择系统比单独使用其中任何一种反选择基因的选择作用都更强,为基因工程的研究提供了一种有用的选择工具。