论文部分内容阅读
目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多种肺外和肺内致病因素引起的急性炎症性肺损伤。在ALI/ARDS的生物学过程中,miRNA-150(miR-150)被认为参与了多种生理和病理过程,包括免疫和炎症反应、造血细胞分化和免疫细胞的激活,这对ARDS的发展至关重要。然而,miR-150在ALI/ARDS中的具体机制研究尚未见报道。本研究目的在于检测ARDS患者血清中miR-150的水平,探究miR-150对Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549的影响并以动物实验证实miR-150在ALI小鼠模型中的作用效果。方法:第一部分:本队列研究招募了 120名ARDS患者和60名性别与年龄相匹配的健康志愿者。统计各组的急性生理和慢性健康评估(APACHE)Ⅱ评分、序贯器官衰竭评估(SOFA)评分和肺损伤评分(LIS);分析两组的基线特征,如年龄、性别、体重指数(BMI)、ARDS的危险因素、ICU入院时的疾病严重程度;荧光定量qRT-PCR用于检测受试者血清miR-150的水平;ELISA法检测血清中相关细胞因子的表达情况;所有受试者随访28天,分析28天病死率。第二部分:健康雄性SPF级BALB/c小鼠,6~8周,18~22g。按照随机数字表法将小鼠分为4组(n=40):PBS对照组、ARDS模型组、ARDS+miR-150组、ARDS+miR阴性对照组,每组各10只。用2%水合氯醛(0.2 ml/10 g)麻醉BALB/c小鼠(每组10只),并用无菌塑料导管经口插管进入气管。用LPS(5 mg/kg)滴鼻建立ALI模型,并以注射相同体积IPBS的小鼠作为对照组。将agomir-150过表达载体和agomir阴性对照(agomir-NC)经尾静脉注射入小鼠体内。每天检测小鼠的生存情况并记录,连续观察3天。3天后,摘取各个处理组小鼠的肺组织,其中左肺组织嵌入石蜡中,行5μm厚度切片,并用苏木精和伊红(HE)染色;小鼠的右肺组织与脾组织提取mRNA,采取定量RT-qPCR技术检测miR-150与IL-1β、IL-6与TNF-α炎性因子mRNA的表达情况。取各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)以及眼球血,血液吸取后离心,分离得血清,采用ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6与TNF-α水平,流式细胞术进行白细胞或中性粒细胞的计数。第三部分:脂质体转染法将miR-150模拟物转入A549细胞上调miR-150的表达;特异性AKT3 siRNA构建的慢病毒表达载体侵染人Ⅱ型肺泡上皮A549细胞;各实验组细胞予以不同浓度的LPS诱导,并在6h、12h、24 h、36h、48h等时间点提纯细胞总蛋白以及上清,行定量分析;Westernblot检测炎症因子、自噬与凋亡相关蛋白以及NF-κB、JNK信号通路的蛋白表达。采用ELISA分析细胞上清液炎性因子水平,用Annexin V-FITC/PI双染细胞经流式细胞术检测细胞的凋亡情况,CCK-8检测A549细胞的增殖能力;双荧光素酶报告基因明确miR-150与AKT3的直接转录后调控关系。结果:第一部分:与健康对照组相比,ARDS患者血清miR-150水平显著降低(P<0.01)。非生存组的miR-150表达水平低于生存组(P<0.01)。与正常对照组比较,ARDS患者血清IL-1β、IL-6与TNF-α的分泌水平明显高于对照组(P<0.01);非生存组的IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平明显高于生存组(P<0.01)。血清miR-150的表达水平与ARDS患者血清IL-1β、IL-6和TNF-α的水平呈负相关(P<0.001)。此外,miR-150和 APACHE Ⅱ 评分(r=-0.778,P<0.001)、SOFA 评分(r=-0.654,P=0.001)、肺损伤评分(r=-0.599,P<0.001)之间存在显著负相关。miR-150水平与PaO2/FiO2(r=0.809,P<0.001)显著正相关。受试者操作特征(ROC)曲线显示,miR-150表达的最佳截止值为1.220(特异性:96.67%,敏感性:92.50%),miR-150 曲线下面积(AUC)(0.989;95%CI:0.978-0.999)明显高于 IL-1β(0.854)、IL-6(0.862)或 TNF-α(0.937)(P<0.001)。Kaplan-Meier曲线证实,与低miR-150水平的ARDS患者相比,高miR-150水平的ARDS患者28天生存率明显更高(P<0.001)。Cox比例风险回归分析表明,除了 APACHE Ⅱ评分、SOFA评分和炎性细胞因子外,miR-150也是影响ARDS患者28天生存率的独立危险因素(危险比:9.135,95%可信区间:2.246-37.156;P=0.002)。第二部分:LPS处理后第3天,与PBS对照组相比,BALF、外周血和脾细胞中的miR-150表达水平显著降低(P<0.01)。miR-150的过表达有效降低了 LPS诱导的急性肺损伤小鼠的白细胞计数,特别是中性粒细胞;miR-150的过表达也有效降低了LPS诱导的急性肺损伤小鼠BALF中炎性细胞因子的分泌(P<0.01)。同时,miR-150还降低了 LPS处理的ALI小鼠BALF中总蛋白、白蛋白和IgM的水平(P<0.05)。本组对肺组织切片进行染色发现,PBS处理小鼠的肺组织结构正常,而LPS处理小鼠的肺组织出现严重水肿和中性粒细胞浸润。在给予LPS后的第一天,与单独使用LPS的小鼠相比,miR-150明显延长了具有LPS和miR-150过表达载体的小鼠的存活率(P<0.01)。此外,不同组72小时的存活曲线显示,miR-150过表达组与其他三组之间具有显著统计学差异(P<0.01),表明miR-150显著提高了 ALI小鼠的存活率。第三部分:LPS处理72小时以后,LPS以时间依赖性方式显著抑制细胞活力(P<0.05)。在不同浓度的LPS处理72小时后,miR-150的表达水平以剂量依赖性的方式显著降低(P<0.01)。当LPS处理A549细胞72 h时,与PBS对照组相比,LPS显著增加了 A549细胞的凋亡(P<0.001),降低了Bcl-2水平,升高了 Bax、cleaved-caspase-3 和 cleaved-caspase-9 水平(P<0.01)。此外,与 PBS 对照组相比,LPS明显增加了 A549细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平(P<0.001)以及LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达(P<0.05)。这些数据表明,LPS诱导了 A549细胞损伤。相反,过表达的miR-150明显减轻了 LPS对A549细胞活性的抑制,同时也抑制了 LPS诱导的细胞凋亡,逆转了凋亡相关蛋白的表达水平,抑制了 IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平,并降低了 LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达。TargetScan官网预测结果显示,AKT3 3’-UTR的1211-1218位是miR-150的潜在靶点。Western blot分析表明,与miR-NC相比,miR-150模拟物转染的A549细胞中的AKT3蛋白水平显著降低(P<0.01)。荧光素酶报告基因法明确miR-150模拟物显著降低了与野生型(WT)AKT3 3’-UTR共转染的HEK-293T细胞的相对荧光素酶活性(P<0.01)。然而,具有突变型(MUT)AKT3 3’-UTR的HEK-293T细胞中的相对荧光素酶活性没有改变(P>0.05)。AKT3 沉默通过升高 Bcl-2 水平,降低 Bax、cleaved-caspase-3 和 cleaved-caspase-9的水平抑制了 A549细胞炎性因子的的分泌,稳定了细胞功能,减少了细胞凋亡,通过降低LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达抑制细胞自噬;AKT3沉默更抑制了 IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。值得注意的是,与其他三组相比,miR-150与AKT3沉默协同保护了A549细胞免受LPS诱导的细胞损伤(P<0.01)。与单纯LPS刺激相比,在LPS存在的情况下,通过miR-150模拟物或si-AKT3诱导,p-JNK、p-p65和p-IκBα的表达水平均明显降低(P<0.01)。另外,AKT3沉默明显加重了 miR-150模拟物对p-INK、p-p65和p-IKBα表达的抑制作用(P<0.01),即miR-150过表达与AKT3沉默发挥了协同抑制作用。同时,我们也推测,miR-150可能通过靶向AKT3途径抑制JNK和NF-κB通路。结论:miR-150对ARDS患者预后判断具有一定的临床意义。miR-150过表达有效地缓解了 ALI小鼠的肺内炎性反应,降低了 ALI小鼠的发病风险,提高了 ALI小鼠的生存能力。miR-150通过直接靶向AKT3抑制JNK和NF-κB通路,保护A549细胞免受LPS诱导的炎性损伤、自噬与凋亡。miR-150可作为治疗ALI/ARDS的潜在靶点,为后期的临床应用提供了可行的理论基础。