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目的本课题通过构建氡暴露细胞和动物模型及相应虎杖苷防护实验模型,观察细胞增殖速度、迁移能力、肺组织损伤及EMT标志物的改变,探索氡暴露诱发人支气管上皮细胞EMT的过程和小鼠肺组织损伤机理,从分子、细胞及整体水平上阐明不同剂量氡及其子体照射诱发上皮细胞EMT的过程及分子机制,确定EMT在氡致肺损伤中的作用;同时探索虎杖苷在氡暴露损伤中的防护作用,为氡暴露损伤的辐射防护提供理论依据及新思路。方法(1)利用生态氡室构建氡暴露小鼠模型:雄性BALB/c小鼠(6只/组)吸入105 Bq/m3的氡气,10h/天,6天/周,累积氡暴露剂量分别达60WLM和120 WLM时,检测小鼠血清SOD活性和MDA含量,HE染色和Masson染色分别观察氡暴露致肺组织病理学变化及纤维沉积情况。免疫组织化学法和Western blot技术检测肺组织EMT相关基因表达。(2)构建氡暴露细胞模型:以人支气管上皮细胞(16HBE和BEAS-2B)为研究对象,直接暴露在20000 Bq/m3氡及其子体环境中,每次暴露20min,每3天暴露一次,重复暴露2次作为染氡1代(Rn1)细胞,选取染氡6代(Rn6)和染氡12代(Rn12)细胞进行后续实验。采用相关试剂盒检测细胞ROS水平和SOD活性,化学发光法检测细胞ATP水平,探针法检测细胞线粒体膜电位(MMP),CCK8法检测细胞增殖,粘附试剂盒检测细胞粘附性,Transwell迁移和划痕实验确定氡暴露后细胞的迁移能力。RT-PCR测定EMT标志物基因mRNA变化量;免疫荧光和Western blot技术检测EMT发生时的蛋白改变情况。(3)利用上述构建好的氡暴露细胞和动物模型探索氡暴露诱发上皮细胞EMT的分子机制。Western blot分析氡暴露细胞和染氡小鼠肺组织相关通路蛋白表达水平。使用该通路抑制剂干预后,CCK8法检测染氡细胞增殖能力,粘附试剂盒确定细胞粘附力大小,蛋白免疫印迹法检测EMT蛋白表达水平。(4)构建氡暴露虎杖苷干预细胞模型:在构建好的氡暴露细胞模型上直接加入终浓度为100 μmol和200 μmol的虎杖苷,作用24h,检测加入虎杖苷后细胞增殖、细胞粘附和细胞迁移能力,确定虎杖苷干预后EMT相关基因和通路蛋白表达情况。(5)构建虎杖苷氡暴露防护细胞模型:细胞在每次氡暴露前后加入200 μmol虎杖苷作为防护剂,其余条件与单独氡暴露组相同,之后测定细胞增殖能力、粘附性能和迁移能力改变,检测暴露前后加入虎杖苷对氡暴露细胞EMT标志物表达水平及相关通路蛋白表达的影响。(6)构建虎杖苷氡暴露防护小鼠模型:雄性BALB/c小鼠在每次吸入氡气前半小时腹腔注射50 mg/kg和100 mg/kg虎杖苷溶液200μL,6只/组,其余条件与单独氡染毒组小鼠相同。当累积染氡剂量达120 WLM时,检测各组小鼠血清SOD活性和MDA含量,HE和Masson染色分别观察肺组织病理学改变和纤维沉积,免疫组化检测EMT重要标志物在肺组织中的表达,Western blot检测相关通路蛋白表达水平。(7)SPSS 20.0软件进行统计分析,两独立样本间的显著性检验采用t检验。多组间的结果分析使用单因素方差分析。设P<0.05认为差异具有统计学意义。结果(1)与对照组比较,氡暴露组小鼠血清MDA含量增加,SOD活性下降,肺组织肺泡壁变薄,肺间隔增厚,出现肺大泡,肺组织可见炎性侵润。肺组织胶原纤维沉积增多,纤维化指标α-SMA表达增加;肺组织出现EMT上皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增多;p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达升高。60WLM氡暴露组小鼠体重无明显改变,120 WLM组小鼠体重明显减轻。(2)氡暴露细胞ROS水平升高,SOD活性下降,MMP和ATP水平改变不明显。氡暴露细胞增殖能力提高,粘附性下降,细胞迁移能力增强;E-cad基因表达降低,FN1、Vimentin、N-cad、α-SMA 和 Snail 表达增高。氡暴露细胞 MMP2/TIMP2平衡失调。(3)氡暴露细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和β-catenin表达增加。氡暴露小鼠肺组织p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达也增高。加入AKT或mTOR抑制剂后,氡暴露细胞增殖能力减弱、细胞粘附性增加,EMT标志物E-cad表达升高,FN1、Vimentin、N-cad、α-SMA 和 Snail 表达减弱。(4)虎杖苷干预后,氡暴露细胞ROS水平降低、SOD活性增加,粘附性变化不明显,细胞迁移能力减弱,E-cad蛋白表达增加,FN1、Vimentin、N-cad、α-SMA和Snail表达降低。p-AKT和p-mTOR表达减弱。(5)与单独氡暴露组比,染氡前后加入虎杖苷可使氡暴露细胞ROS水平明显降低,SOD活性增加,粘附性能提高,细胞迁移能力显著减弱,E-cad蛋白表达增加,FN1、Vimentin、N-cad、α-SMA 和 Snail 表达明显降低。p-AKT 和 p-mTOR表达明显减弱。(6)与120 WLM组小鼠相比,虎杖苷氡暴露防护组小鼠体重增加,血清MDA含量降低,SOD活性升高。肺组织肺大泡数量和肺间隔增厚程度减少,肺组织胶原纤维沉积减少,EMT间质细胞标志物(FN1、Vimentin、Snail)和纤维化指标α-SMA表达减少。p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达明显减弱。结论(1)氡暴露早期可诱发人支气管上皮细胞和小鼠肺组织发生EMT,且随氡暴露累积剂量的增大EMT程度逐渐加重。(2)PI3K/AKT/mTOR通路参与氡暴露诱发支气管上皮细胞EMT的发生。(3)虎杖苷可降低氡暴露诱发的氧化应激,减弱氡暴露诱发的支气管上皮细胞EMT和小鼠肺组织纤维化,对氡暴露损伤具有良好的辐射防护作用,且暴露前后使用辐射防护效果更佳。虎杖苷防护作用可能与其抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活有关。