整合素是功能保守的细胞粘附受体大家族的成员,主要由α亚基与β亚基非共价结合形成。β亚基中的β3亚基分别可与αIIb亚基与αv亚基结合形成αIIbβ3与αvβ3两种整合素。整合素αvβ3广泛表达,而整合素αIIbβ3主要特异性表达于血小板与巨核细胞表面,是血小板膜上最丰富的受体,被视为血小板活化的最终通路,在介导血小板的双向信号转导的过程中起着至关重要的作用。整合素主要由大的胞外结构域、跨膜螺旋区和短的胞浆段构成。β3亚基胞浆段对整合素的信号传导十分重要,β亚基胞浆段较短且无酶活性但含有高度保守的结构域:近膜端的α螺旋,近膜端的NPx Y基序以及远膜端的Nxx Y基序。既往研究显示:在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中β3E726Q突变株在固相化的纤维蛋白原上有伸展不良的现象,并有突起小泡形成的现象,且这种现象可被肌凝蛋白ATPase抑制剂blebbistatin所抑制。人工表达整合素αIIbβ3的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是血小板的替代模型,被广泛应用,但CHO细胞表面无血小板特异性的受体和骨架蛋白,故不能完全代替血小板。因此,我们利用转基因技术,通过同源重组修复的方式,引入目的点突变,建立转基因小鼠模型,拟研究β3E726Q转基因小鼠的血小板功能,观察是否β3E726Q影响血小板内的信号转导和骨架蛋白重组。目的:通过繁殖并鉴定整合素β3E726Q转基因小鼠,探究其血小板功能,观察β3E726Q突变在信号转导和骨架蛋白重组中的作用。方法:1.构建、繁殖并通过PCR鉴定一定量的β3E726Q转基因小鼠。2.检测β3E726Q转基因小鼠功能:心脏采血,检测洗涤血小板的双向信号转导,包括内向外信号转导事件-游离纤维蛋白原的结合,外向内信号转导事件-固相化的纤维蛋白原上的伸展、血小板聚集、纤维蛋白凝块的回缩以及闭孔时间等。结果:1.通过PCR和测序成功鉴定整合素β3E726Q转基因小鼠,测序结果显示杂合子小鼠的扩增产物在其突变位点的峰形为“双峰”,纯合子与野生型其峰形均为“单峰”,依据其突变位点的序列信息判断,若“GAA”突变为“CAA”则为突变型,若仍为“GAA”则为野生型。2.与野生型小鼠血小板相比,整合素β3E726Q转基因小鼠血小板与游离纤维蛋白原的结合能力未受损,提示内向外信号转导正常。3.野生型小鼠血小板在固相化纤维蛋白原上伸展良好,而在固相化的纤维蛋白原上整合素β3E726Q转基因小鼠血小板表现为伸展不良。4.整合素β3E726Q转基因小鼠的纤维蛋白凝块回缩速度与野生型小鼠纤维蛋白凝块回缩速度接近。5.用PFA-200检测Col/Epi和Col/ADP包被的膜测定小孔闭合时间,结果显示野生型小鼠全血闭孔时间正常,而整合素β3E726Q转基因小鼠的全血在全血耗竭前不闭合。结论:通过研究整合素β3E726Q转基因小鼠血小板功能,我们证实了整合素β3E726Q转基因小鼠血小板保留内向外信号转导,纤维蛋白凝块回缩功能正常,在固相化纤维蛋白原上伸展不良,血栓形成能力下降。