体细胞克隆法制备红色荧光转基因猪胚胎研究

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本试验用红色荧光蛋白转基因猪胎儿成纤维细胞做为供核细胞,体外成熟猪卵母细胞作为受体细胞,构建了转红色荧光蛋白基因的重构胚胎,并进行了胚胎移植试验。探索了猪卵母细胞体外成熟、去核及融合,以及重构胚体外发育的优化条件。主要研究结果如下:   1、TCM-199基础液中添加不同物质对卵母细胞体外成熟的影响。与无添加对照组卵母细胞成熟率76.64%比较,0.1%PVA、10%FBS和10%PFF的卵裂率分别是80.00%、78.21%、87.04%;0.1%PVA和10%FBS没有显著差异(P>0.05),10%PFF显著高于其它组(P<0.05)。这些结果表明,用添加10%PFF的TCM-199体外成熟液效果最好。   2、卵母细胞体外成熟培养的不同时间对重构胚发育的影响。设置三个培养时间(37h、40h、43h)培养的卵母细胞,核移植后的卵裂率分别为65.26%、64.44%、63.33%,三组间没有显著差异(P>0.05);37h成熟的囊胚率17.72%显著高于40h和43h的10.33%和8.75%(P<0.05),这些结果表明,卵母细胞体外成熟37h进行核移植为宜。   3、转基因和非转基因猪胎儿成纤维细胞对重构胚的构建和体外发育的影响。分别用转红色荧光蛋白基因非转基因的猪胎儿成纤维细胞做为供核细胞构建重构胚的结果显示融合率分别为70.34%和、68.50%;卵裂率分别为70.59%和68.98%;囊胚率分别为27.78%和26.65%;两组间没有差异(P>0.05)。这些结果表明,转红色荧光蛋白基因猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞,没有影响重构胚的发育。   4、两种不同培养液对重构胚体外发育的影响。用NCSU-37和PZM-3两种不同胚胎培养液进行重构胚的体外培养,结果显示,卵裂率分别为63.33%和67.5%;囊胚率分别为15.79%和18.51%;两组间没有显著差异(P>0.05)。   5、转基因重构胚移植试验。用促性腺激素同期发情的5头受体母猪进行胚胎移植,胚胎移植后一个月经B超检测证实,有4头妊娠。但是,在2-3各月期间,出现胎儿退化和流产现象,最终没有顺利产出转基因猪。在妊娠120天时进行剖腹产,在子宫中发现退化的胎儿已形成吸收肉囊。
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