米糠谷氨酸脱羧酶固定化及制备γ-氨基丁酸的研究

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谷氨酸脱羧酶(GAD)是米糠的一种内源酶,可以催化谷氨酸(Glu)或其钠盐通过脱羧反应转化为γ-氨基丁酸(GABA)。而GABA作为一种食品保健因子,可以添加到食品或者药品中,以起到降低血压、治疗癫痫、抗衰老和调节激素的分泌等功能。本论文以新鲜米糠为原料,制备了GAD;研究了GAD的固定化工艺及酶学性质;并对用固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)制备GABA及GABA的纯化工艺进行了研究。首先,依次采用DEAE-Sephrose FF,HW-55F和Superdex200对米糠GAD进行了纯化,并选择以磁性壳聚糖微球作为GAD的固定化载体材料,对GAD进行固定。采用乳化交联法制备了磁性壳聚糖微球,微球的外观呈黑褐色的圆珠状,内部为多相结构;其平均粒径为6.5μm,表观密度为0.4912g/mL,比表面积达到391.9m2/g;磁响应性好,在磁场作用下,2min内即能达到沉降平衡。通过单因素试验和正交试验,对米糠GAD的固定化工艺进行了研究。优化得到最佳固定化的工艺条件为:用于充分溶胀磁性壳聚糖微球的磷酸盐缓冲液的pH为5.2,戊二醛浓度为1.5%,交联时间为4h,固定化时间为5h。在此条件下,IGAD的酶活力回收率为39.41%。其次,对IGAD的酶学性质进行了研究。IGAD的最适温度为45°C,最适pH为5.2。与游离酶相比,其耐热和耐酸性能增强。贮存稳定性也得到了较大程度的提高,在4°C下贮存30d后,酶活力依旧保持在初始酶活的68.59%。游离GAD对Glu的Km值和Vmax分别为37.3mmol/L和2.5661mg/min,对磷酸吡哆醛(PLP)的Km值和Vmax分别为1.12μmol/L和1.5870mg/min;IGAD对Glu的Km值和Vmax分别为52.2mmol/L和1.6447mg/min,对PLP的Km值和Vmax分别为2.87μmol/L和1.2794mg/min。然后,对利用IGAD催化底物谷氨酸钠制备GABA的工艺进行了研究。通过单因素试验和正交试验,优化得到制备GABA的最佳工艺条件为:以NaH2PO4-Na2HPO(4pH5.2)作为缓冲液,缓冲液离子强度为0.04mol/L,底物浓度为0.05mol/L,反应时间为14h。在此条件下,制备液中GABA的浓度为2.205mg/mL。最后,采用离子交换法对利用IGAD制备的GABA的纯化工艺进行了研究。选用717氯型阴离子交换树脂来脱除GABA溶液中的磷酸盐,将pH调至7.3进行吸附,发现717氯型阴离子交换树脂对磷酸盐的吸附速度快,吸附效果好,可在30min内快速达到吸附平衡,且对磷酸盐的吸附率达到79.1%。选用001×10阳离子交换树脂来吸附GABA,吸附在40min内即可达到吸附平衡;通过调节上样液pH为3.0,以上样浓度为2mg/mL进行吸附,吸附完全后以2.0mol/L的氨水溶液作为洗脱剂进行洗脱,收集液中GABA的回收率为92.18%,纯度达到90.32%。
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