本文报道了水中亚硝酸盐和氨氮浓度的升高对我国重要养殖种类中华绒螯蟹幼体的急性毒性和亚致死毒性效应，初步阐明了幼蟹对亚硝酸盐和氨氮的解毒途径，并探讨了日粮中添加维生素E（VE）对幼蟹营养调节能力和抗应激能力的影响。研究结果可为水生动物毒理学和营养免疫学提供基础资料，同时也对甲壳动物应激评价体系的建立提供参考依据，有助于推动甲壳动物养殖业的可持续发展。1．中华绒螯蟹幼体对亚硝酸盐和氨氮的半数致死浓度(LC₅₀)及解毒途径急性毒性试验的结果表明，中华绒螯蟹幼体在亚硝酸盐中暴露24h-、48h-、72h-和96h-的LC₅₀分别为43.87-、40.24-、38.87-、38.87-mg／l；对水中总氨氮的LC₅₀分别为251.68-、217.61-、156.05-、119.67-mg／l，非离子氨的LC₅₀值为2.75-、2.37-、1.70-、1.31-mg／l。亚硝酸盐和氨氮对中华绒螯蟹幼体的安全浓度分别为3.8和12.0 mg／l，说明中华绒螯蟹对氨氮的耐受性较高。分析幼蟹血淋巴对相应暴露物的累积程度可看出，血淋巴中亚硝酸盐的累积量随水环境中亚硝酸盐浓度的增高而增多，且血淋巴中亚硝酸盐浓度的升高幅度远大于水中亚硝酸盐浓度的升高幅度，它们之间并不呈线性递增而是表现出倍数增长关系；而血淋巴中的氨氮浓度与水环境中的氨氮浓度较接近，随环境中氨氮浓度的升高呈线性增加。表明幼蟹血淋巴更容易对亚硝酸盐发生累积。急性亚硝酸盐暴露和急性氨氮暴露均可使中华绒螯蟹幼体血淋巴中谷氨酸盐、谷氨酰胺、尿素的含量以及肝胰腺中谷氨酰胺的含量显著增加，但随暴露时间的延长，血淋巴中谷氨酸盐、尿素及肝胰腺中谷氨酰胺的含量不断增加，而血淋巴中谷氨酰胺的含量不断下降。这说明幼蟹可将体内过多的亚硝酸盐和氨氮部分转化为谷氨酰胺或参与鸟氨酸循环以尿素的形式排出体外。相同浓度的亚硝酸盐使血淋巴中谷氨酸盐和谷氨酰胺含量上升的幅度远大于相同的氨氮暴露浓度，说明亚硝酸盐的解毒途径在很大程度上更倾向于转化为谷氨酰胺。此外，机体还可将部分亚硝酸盐转化为硝酸盐。2．亚硝酸盐和氨氮对中华绒螯蟹幼体的急性毒性效应在96h-LC₅₀的基础上，分别设计了对照组、10-、20-、30-、40-mg／l亚硝酸盐暴露组以及20-、40-、60-、80-mg／l氨氮暴露组，分别在暴露的3h、6h、24h、48h取样，探讨了急性亚硝酸盐胁迫和急性氨氮胁迫对幼蟹能量利用、免疫、渗透调节以及应激蛋白70（HSP70）表达量的影响。研究结果表明，急性亚硝酸盐和氨氮胁迫均使幼蟹血淋巴中氧合血蓝蛋白含量下降，导致机体携氧能力降低，机体主要通过糖酵解途径提供能量，肝糖元含量下降，血糖浓度升高，肝胰腺及血淋巴中乳酸含量不断上升。与此同时，血淋巴中甘油三酯的含量下降，说明机体还需动用大量脂肪来满足其本身的能量需求。此外，急性亚硝酸盐胁迫使血糖的升高幅度及氧合血蓝蛋白的下降幅度均大于急性氨氮胁迫，因而亚硝酸盐胁迫导致组织中乳酸含量的升高幅度也相应大于氨氮胁迫。低浓度的亚硝酸盐暴露和氨氮暴露在短期内可使幼蟹血细胞数显著增多，并可显著提高肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性，表现出“毒物兴奋效应”。随着暴露时间延长，这种兴奋效应逐渐消失，血细胞数和SOD活性均逐渐下降。高浓度的亚硝酸盐胁迫和氨氮胁迫均使幼蟹血细胞数减少，并抑制肝胰腺SOD活性，使机体对超氧阴离子的清除能力下降，从而在一定程度上降低了机体的免疫力。肝胰腺中丙二醛（MDA）含量随亚硝酸盐和氨氮暴露浓度的升高而升高，且随暴露时间的延长在组织中的累积量增大，说明亚硝酸盐和氨氮暴露使组织中脂质过氧化程度加剧。随着脂质过氧化程度加剧，细胞膜结构将遭受一定程度的损伤，导致细胞膜的通透性改变，因而血淋巴的渗透压及主要离子浓度也会发生相应变化。亚硝酸盐和氨氮胁迫可使血淋巴中[Na⁺]、[K⁺]、[Cl^-]、强离子差以及渗透压下降。在亚硝酸盐处理组中，血淋巴中Cl^-和渗透压对亚硝酸盐的变化较敏感，不同暴露浓度之间差异均显著。而在氨氮处理组中，血淋巴中Na⁺对氨氮的变化较敏感，不同暴露浓度之间差异均显著。环境胁迫除了可影响机体的生理生化反应外，还将在细胞水平上引发一系列变化。采用Western-blotting法研究亚硝酸胁迫对幼蟹鳃组织中HSP70表达影响的结果表明，中华绒螯蟹幼体经10mg／l和20mg／l的亚硝酸盐处理后，鳃组织中HSP70的表达量在应激6h后达到最大，而经30mg／l和40mg／l的亚硝酸盐处理后，HSP70的表达量在应激3h后达到最大。而且各浓度组所诱导的HSP70的最大表达量与水中亚硝酸盐的浓度呈正相关。因此应激蛋白能在生物体受到严重危害前，作为早期的预警标志应用于机体生理状况的评价中。3．亚硝酸盐和氨氮对中华绒螯蟹幼体的慢性毒性效应为了解亚硝酸盐和氨氮的长期暴露对中华绒螯蟹幼体生长及免疫的影响，揭示亚硝酸盐和氨氮的长期暴露对幼蟹的毒害机理，共设计了对照组、5-、10-、15-、20-mg／l亚硝盐暴露组和10-、20-、30-、40-mg／l氨氮暴露组，探讨了不同浓度的亚硝酸盐和氨氮暴露60d对中华绒螯蟹幼体生长、免疫及肝胰腺显微结构和超微结构的影响。结果表明，在应激的前10d，幼蟹的死亡数随亚硝酸盐和氨氮浓度的升高而升高，且随应激时间的延长，其死亡数不断增加。而且亚硝酸盐暴露和氨氮暴露均可显著降低幼蟹的体增重，增加饲料系数。当水中亚硝酸盐浓度高于5mg／l时，肝胰腺中酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活性显著下降；当氨氮浓度达到20mg／l以上时，肝胰腺ACP和ALP活性才显著低于对照组。这说明亚硝酸盐对肝胰腺ACP和ALP活性的影响大于氨氮，相同浓度的亚硝酸盐暴露对机体蛋白合成和免疫的影响程度强于氨氮暴露。对肝胰腺超微结构的研究结果表明，幼蟹暴露于20mg／l亚硝酸盐溶液和40mg／l氨氮溶液60d后，肝胰腺部分细胞器出现了空泡化，具体体现在核膜不完整并出现断裂现象，核内物质外溢，细胞核空泡化；大部分线粒体内嵴消失。因此细胞器解体而造成的细胞坏死可能是亚硝酸盐和氨氮胁迫作用的主要靶标。4．日粮中添加VE对中华绒螯蟹营养调节能力和抗应激能力的影响为研究日粮中添加一定量的VE对胁迫效应的缓解作用，共设计了3种日粮，其中日粮2（VE含量为660mg／kg）和日粮3（VE含量为960mg／kg）是分别在对照组（基础日粮，VE含量为360mg／kg）的基础上添加了300-、600-mg／kg VE，投喂60天后，将每个实验组的半数蟹投到10mg／l的亚硝酸盐水体中，分别研究了3种不同日粮在亚硝酸盐应激前后对中华绒螯蟹幼体生长、免疫、渗透调节及组织中VE含量的影响。研究结果表明，用日粮2饲喂20d后，可显著提高中华绒螯蟹幼体的特定增长率，降低饲料系数；然而，日粮3在一定程度上却抑制了幼体的生长，提高了饲料系数。亚硝酸盐应激显著提高了肝胰腺和鳃组织中SOD活性和MDA含量以及肝胰腺中ACP活性、鳃中ALP活性，但在日粮中添加VE后可使其上升幅度减小，以日粮2的变化幅度最小；同时亚硝酸盐应激还可显著降低肝胰腺中ALP活性、鳃中ACP活性，但日粮中添加VE后可使其下降幅度减小，以日粮3的降幅最小。亚硝酸盐应激显著降低了对照组中血淋巴氧合血蓝蛋白浓度和三组日粮的血淋巴总蛋白浓度，而VE添加组中氧合血蓝蛋白浓度在经受亚硝酸盐胁迫后变化不显著。组织中VE含量随日粮中VE添加量的增加而增加，亚硝酸盐应激均在一定程度上消耗了组织中的VE，从而使其含量下降，日粮3中肝胰腺和鳃中VE的降幅最大。综上所述，日粮2（VE含量为660mg／kg）对幼蟹的营养调节作用优于基础日粮（VE含量为360mg／kg）和日粮3（VE含量为960mg／kg）。5．亚硝酸盐胁迫下中华绒螯蟹幼体对VE的最适需要量为了解机体在环境胁迫下对VE的需要量，本试验共设计了0-、300-、1000-、2000-mg／kgVE四种日粮（分别为日粮1、日粮2、日粮3、日粮4），研究这4种日粮对暴露在10mg／l亚硝酸盐水体的中华绒螯蟹幼体的生长、免疫及抗应激能力的影响。研究结果表明，除日粮4组外，其它3组亚硝酸盐应激下幼蟹的体增重和特定生长率随日粮中VE含量的增加而显著增加，饲料系数随日粮中VE含量的增加而显著下降，而日粮4组的体增重、特定生长率和饲料系数介于日粮1和日粮2之间；随饲喂时间的延长，幼蟹的体增重相对下降，饲料系数显著提高。而幼蟹的存活率以日粮1组最低，其次为日粮4组，日粮2和日粮3组之间无显著差异。幼蟹肝胰腺中抗氧化酶活性以日粮3组为最高，且随饲喂时间的延长而显著增加，而脂质过氧化程度也以日粮3组为最低，随饲喂时间的延长而显著下降。经空气暴露6h后，肝胰腺中抗氧化酶活性均有不同程度的下降，脂质过氧化程度加剧，但以日粮3组的变化幅度最小。当日粮中缺乏VE时，肝胰腺和鳃中的VE含量为100μg／kg左右。除日粮4外，组织中VE含量随日粮中VE含量的增加而升高。幼蟹在空气中暴露6h后，组织中VE含量显著下降，仍以日粮3组中的组织VE含量最高，日粮4组次之，日粮1组中组织VE含量最低，各日粮组中肝胰腺和鳃中VE含量两两间均存在显著差异。因此，幼蟹在亚硝酸盐应激下对日粮中VE的最适需求量为1000mg／kg左右。