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自1937年首次从雏鸡肠道中分离获得肯塔基沙门菌(Salmonela Kentucky)以来,该菌逐渐成为全球畜禽中最常见的沙门菌血清型之一。肯塔基沙门菌严重的多重耐药特性是该菌流行率上升的重要因素,严重危害畜禽生产和人类公共卫生安全。随着国家减抗、替抗战略需求的实施,亟需疫苗等减抗替抗产品的研发。肯塔基沙门菌诱导宿主炎性应答规律的阐明有助于相关疫苗的开发。目前,肯塔基沙门菌的生物学功能及其引起的宿主天然免疫应答效应方面的研究报道较少。本研究通过NF-κB荧光素酶报告系统,基于不同肯塔基沙门菌分离株对NF-κB报告基因的激活程度,评价肯塔基沙门菌的炎性应答水平;筛选明显存在炎性差异的菌株并测定其生物学功能。进一步通过体内外试验分析宿主抗肯塔基沙门菌的天然免疫应答,以期为肯塔基沙门菌疫苗的研发和设计提供参考和思路。1.不同血清型沙门菌诱导NF-κB活化能力的评价以HCT116-NF-κB为模型,利用NF-κB萤火虫荧光素酶报告系统评价不同血清型沙门菌诱导的NF-κB荧光素酶活性,以反映宿主炎性应答水平。结果显示,肠炎沙门菌诱导的NF-κB活性最强,平均荧光素酶活性分别为鸡白痢沙门菌和都柏林沙门菌的6.45倍(p<0.001)和3.65倍(p<0.001);鼠伤寒沙门菌诱导的NF-κB活性位居第二,平均荧光素酶活性分别为鸡白痢沙门菌和都柏林沙门菌的4.89倍(p<0.001)和2.76倍(p<0.001);不同肯塔基沙门菌分离株诱导的NF-κB活性水平表现多样化。总体来说,不同血清型沙门菌诱导炎性应答能力差异较大。宿主泛嗜性的鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌诱导炎性应答能力较高,而宿主特异性的都柏林沙门菌和鸡白痢沙门菌诱导炎性应答能力较低,其中鸡白痢沙门菌诱导的炎性能力最低。此外,我们利用该系统评价了猪源、鸡源、鸭源和人源肯塔基沙门菌分离株诱导宿主炎性应答的水平,发现人源肯塔基沙门菌诱导炎性应答的能力最高。基于NF-κB荧光素酶报告基因筛选系统,筛选获得诱导宿主炎性差异的两株肯塔基沙门菌分离株,分别为诱导炎性应答能力较高的人源分离株117和诱导炎性应答能力较低的猪源分离株SH142。进一步比较分析了这两株肯塔基沙门菌分离株的生物学特性,结果显示,117和SH142的生化特性和生长速率基本一致;均具有运动性;均可形成生物被膜,且形成生物被膜能力相同。药敏试验结果表明,117和SH142均表现出了多重耐药特性,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类及四环素共四类抗生素耐药;此外,117对氯霉素敏感,而SH142对氯霉素耐药。肯塔基沙门菌117和SH142对人结肠腺癌上皮细胞Caco-2、鼠源巨噬细胞J774A.1、猪肠上皮细胞IPEC-J2的黏附和侵袭能力无明显差异。117和SH142的体外竞争试验结果显示,共培养12 h时,117竞争指数显著高于SH142(p<0.05)。以上结果表明肯塔基沙门菌117和SH142具有相似的生物学特性,但是两者诱导宿主炎性应答的能力存在显著差异。2.肯塔基沙门菌117和SH142诱导宿主炎性应答的比较分析以不同的细胞感染模型评价肯塔基沙门菌117和SH142诱导宿主炎性应答的能力。ELISA检测117和SH142诱导人结肠癌上皮细胞HCT116和鼠源巨噬细胞J774A.1产生炎性因子的变化规律,结果显示,在不同时间点,117诱导的炎性因子IL-8、IL-6和TNF-α均高于SH142;并且117在感染细胞后8 h诱导产生的炎性因子表达量最高。利用qRT-PCR检测117和SH142感染Caco-2细胞、J774A.1细胞和IPEC-J2细胞8 h后的炎性因子mRNA表达,结果显示117感染不同来源细胞后诱导分泌的IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平均高于SH142。上述结果表明,肯塔基沙门菌117诱导炎性应答的能力高于SH142分离株。以C57BL/6小鼠为感染模型,体内评价117和SH142诱导炎性应答的差异。ELISA检测血清中炎性因子IL-6的含量,结果显示1 17感染组小鼠血清中IL-6含量在不同时间点均高于SH142感染组;并且在感染第3天和14天时,117诱导小鼠脾脏炎性因子IL-6的转录水平高于SH142感染组。伴随着11 7诱导体内较高的炎性应答能力,细菌定植结果显示,117感染后第14天在肝脏和结肠中被快速清除;而SH142在感染后第21天仍在肝脏和结肠中大量定植,于感染28天后才呈明显下降趋势,上述结果预示着高炎性应答可加速宿主对肯塔基沙门菌的清除。qRT-PCR检测两株肯塔基沙门菌中与诱导炎症相关基因的表达量,结果显示117诱导沙门菌促炎基因的表达量显著高于SH142;反之,抑炎基因的表达量却显著低于SH142,暗示着117诱导产生的炎性应答水平高于SH142。Western blotting试验中,117和SH142均能诱导激活NF-κB,并且117感染组p-κBα表达量显著高于SH142。上述结果均表明,117可以诱导宿主较强的炎性应答。