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本文报道了在多孔硅表面修饰不同的有机单分子膜来固定蛋白质分子。方法途径不同,所得到的嫁接效果也有差异。并对固定在表面的蛋白质作了一系列多样、独立、相关的检测分析。主要研究工作可分为以下三部分概述:
1.多孔硅表面初步修饰及蛋白质的共价连接
首先,多孔硅在微波加热反应条件下形成Si-C键从而共价连接11-烯酸。然后通过与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)/DCC反应这一简单的化学途径,实现了对末端羧酸基团的化学激发。最后,经过NHS修饰后的多孔硅样品在蛋白质的PBS缓冲溶液(pH=8.0)中成功的固定上蛋白质。我们使用了FTIR,XPS对表面修饰的整个过程进行了系列表征。SEM,FL等也被用于对表面固定上的蛋白质的检测分析。
2.多孔硅表面NTA单分子膜的分步嫁接及His-tag Proteins的固定与检测
我们在上述工作基础上,借鉴了IMAC(固定相金属螯合亲和色谱)的原理以达到选择性、可逆性、高效性并且取向可控、生物活性可保持的固定蛋白质的目的。我们设计在多孔硅表面通过原位分步合成反应嫁接上NTA单分子膜。分步反应过程分为五步:(1)新制的多孔硅与11-烯酸在微波加热的条件下反应;(2)上一步反应后末端的羧酸功能团在DCC催化下与NHS中的羟基发生酯化反应,从而在末端连接上NHS。(1,2两步是来源于上面第1部分工作);(3)在碱性水溶液环境下,末端NHS基团离去,ANTA的氨基末端与多孔硅上的羧基末端通过形成肽键共价连接起来;(4)多孔硅表面嫁接上NTA的单分子膜后,与Ni2+发生配位作用从而负载NiⅡ;(5)在His-tag proteins溶液中,蛋白末端所含的两个组氨酸残基取代两个水分子与NiⅡ配位,从而最终在多孔硅表面固定上蛋白。
通过NiⅡ-NTA这一金属螯合系统与His-Tag proteins的配位作用,我们实现了在一个多孔硅样品上进行多样的、相关的检测(包括FTIR,XPS,MALDI-TOFMS,fluorescence和AFM成像,反射干涉谱)。所有这些独立的检测得到的数据相互之间吻合较好,可以预见多孔硅具备在生物传感器应用中成为多重模式平台的潜能。
3.多孔硅表面NTA单分子膜的一步嫁接及His-tag Proteins的固定与检测
一步嫁接反应则是将预先合成的一端双键的NTA衍生物(Compound A)与新制的多孔硅通过微波加热诱导氢化硅烷化反应直接在多孔硅表面嫁接上NTA的单分子膜。这种预先合成的NTA衍生物通过两步反应制备:(1)11-烯酸在DCC催化下与NHS中的羟基发生酯化反应;(2)上步分离提纯后产物与ANTA在DMF溶剂中加热反应。在多孔硅表面嫁接上NTA的单分子膜后,样品接着负载Nin形成螯合物最终选择性的吸附His-tag Protein。FTIR,XPS和DIOS-MS检测均证实了多孔硅表面上NTA单分子膜的存在。我们还使用了FTIR,XPS,MALDI-TOF-MS和fluorescence等多样检测手段来表征多孔硅表面固定的His-tag Trx-urodilatin。另外,我们设计了一种新颖的实验方法来检测表面上保持活性的His-tag proteins。这样一种一步修饰方法为生物传感应用中多重模式平台的制备提供了简便有效的途径。