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猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是一种肠道冠状病毒,在世界范围内引起猪群的高发病率和高死亡率,侵害肠道和呼吸道,主要的症状表现为呕吐、严重腹泻、脱水,对养猪场造成重大经济损失,要控制该病的发生与流行,必须要有相应的诊断技术及疫苗免疫接种。S蛋白是TGEV的保护性抗原,有A、B、C、D 4个主要抗原位点,A位点位于TGEV的表面,是体外病毒中和的抗原区域,也是诱导机体产生中和抗体的主要诱导因子,并发挥着关键作用,此位点的缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体,因此该位点为研究的主要对象。本研究针对TGEV S基因A位点(简写为Sa,下同),构建了重组杆状病毒表达载体并成功表达了融合蛋白rBacmid-TGEV-Sa,制备了针对rBacmid-TGEV-Sa融合蛋白的单克隆抗体,并将rBacmid-TGEV-Sa融合蛋白作为包被抗原,建立了 TGEV抗体的ELISA诊断方法。具体研究内容如下:1表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点重组杆状病毒的构建与鉴定本研究使用实验室保存的猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016为模板,根据猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列,参考王仙等研究设计并合成一对特异性引物,使用RT-PCR方法扩增出Sa基因序列,将TGEV-Sa基因克隆至pFast-bac-HTA杆状病毒表达载体中,再在DH1OBac感受态细胞中转座,通过蓝白斑筛选并进行三次纯化,最后得到了阳性重组穿梭载体质粒,然后质粒在脂质体LipofectamineTM 3000介导下,在Sf9昆虫细胞中进行转染,成功获得了重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa。经过IFA鉴定表明该重组杆状病毒融合蛋白可被抗猪传染性胃肠炎病毒抗体特异性识别为胞浆荧光,SDS-PAGE、Western-blot结果表明获得了大约28 kDa的可溶性重组蛋白,并可被6×His单克隆抗体和猪多抗血清特异性识别,具有良好的反应原性,为应用于抗体筛选和建立血清学检测方法奠定了一定的基础。2猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点单克隆抗体的制备本研究使用的免疫原为第一章中制备的重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa融合蛋白,免疫6周龄Balb/c小鼠,经过细胞融合后,使用间接免疫荧光(IFA)方法进行筛选方法,经过三次融合,成功获得了 5株能稳定分泌抗TGEV的单克隆抗体,分别命名为 Mab-TGEV-2B1、Mab-TGEV-2D1、Mab-TGEV-4E3、Mab-TGEV-5E3、Mab-TGEV-5G2。经亚类鉴定 Mab-TGEV-2B1、Mab-TGEV-2D1、Mab-TGEV-5G2 亚型为IgG1,其他两株亚型为IgM。经过ELISA、Western-blot验证所得单抗只识别TGEV,不与PEDV、PRoV发生交叉反应。将Mab-TGEV-2B1、Mab-TGEV-2D1两株单抗的腹水利用Protein G柱获得了纯化的抗体,为后续建立TGEV检测方法奠定了基础。3检测猪传染性胃肠炎病毒抗体间接ELISA方法的建立本研究以重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa细胞病毒悬液经过超声波破碎的上清作为包被抗原,通过对ELISA各个反应条件的筛选,采用P/N值法进行判定,确定抗原浓度为100μg/mL,4℃包被过夜,5%山羊血清封闭2h,血清1:200稀释,37℃水浴孵育60 min,酶标二抗(HRP-羊抗鼠)37℃水浴孵育60 min,显色15min,作为最终的工作条件。检测22份猪阴性血清确定阳性临界值为0.476,阴性临界值为0.422,介于两者之间判定为可疑。通过特异性、敏感性、重复性试验证实本研究建立的ELISA方法特异性较好,和猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒等其他病毒无交叉反应,敏感性良好,批内、批间试验变异系数均小于10%。使用已建立好的间接ELISA方法与商品化ELISA检测试剂盒和IFA方法进行比较,分别对临床送检的96份猪血清进行检测,结果显示,总符合率都为92.7%。说明本研究建立的ELISA方法可应用于临床TGEV感染的检测,也为进一步开发TGEV商品化诊断试剂盒奠定了一定的物质基础。