癫痫作为神经系统常见疾病,以大脑神经元异常放电所引起的短暂性神经系统功能失常为特征。目前癫痫治疗主要以药物治疗为主,现有抗癫痫药物大都是通过抑制神经环路过度兴奋发挥抗癫痫作用,近年来,越来越多研究聚焦于癫痫中的神经炎症和氧化应激,它们成为研发新治疗策略的靶点。炎症在癫痫发生发展过程中的重要作用已经在临床以及基础研究中得到广泛证实,炎症分子可与其相应受体结合直接或间接影响神经元功能,使神经元兴奋性升高,促使癫痫发作,而癫痫发作也可加重炎症反应。氧化应激伴随癫痫的发生、发展,也是癫痫主要的发病机制之一。当癫痫发作时,神经元长时间异常兴奋,导致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）大量生成,从而破坏细胞内Ca2+稳态,进而加强神经元的兴奋性传递。氧化应激还能通过诱导高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein,HMGB1）分泌增多,促进促炎介质的表达,从而加重炎症反应。超顺磁氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs）是以Fe3O4、γ-Fe2O3等为核心的一种纳米粒。有研究表明,SPIONs可发挥抗氧化酶活性,从而抑制氧化应激过程。炎症与癫痫的发生有着密切的关联,而炎症反应的发生与ROS的过度产生密不可分。因此,具有抗氧化酶功效的纳米颗粒在炎症治疗有应用潜能,可能作为癫痫疾病的治疗的新方向。但是,裸露SPIONs稳定性差,易发生氧化,高表面能使其易发生聚集,在体内易被网状内皮系统清除。此外,裸露的金属和金属氧化物纳米颗粒也会对细胞产生毒性作用,所以需要使用表面修饰剂对其进行修饰。研究表明,糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）可以通过静电结合稳定SPIONs,改善SPIONs易聚集的特性。此外,基础和临床研究证实,肝素还具有抗炎活性以及抗补体激活作用,并且还能通过抑制内皮糖萼降解有效减轻血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）的结构损伤,这些作用也应有利于癫痫治疗。因此,本课题选用UFH为表面修饰剂对SPIONs进行修饰,以改善裸露状态下SPIONs易聚集,生物相容性和稳定性差等不足,并尝试将UFH-SPIONs应用于癫痫的治疗,为基于癫痫新机制研发新药奠定基础。本课题研究的主要内容及其结果如下:1.UFH-SPIONs的制备与表征1.1 UFH-SPIONs 的制备采用化学共沉淀法制备了 SPIONs与UFH-SPIONs。1.2 UFH-SPIONs的聚集状态及粒径和Zeta电位测定使用透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察发现,SPIONs和UFH-SPIONs的单个颗粒粒径在10nm～20nm之间,均具有较小的颗粒尺寸,SPIONs聚集明显,呈多颗粒团簇状态,经UFH修饰后则表现出良好的分散状态,证实UFH的修饰能够改善SPIONs易聚集特性。1.3 UFH-SPIONs水动力学直径测定采用动态光散射法（Dynamic light scattering,DLS）对 SPIONs 和 UFH-SPIONs样品水动力学直径、多分散系数和Zeta电位进行测定。UFH-SPIONs的水合粒径和多分散系数（Polymer dispersity index,PDI）均明显小于SPIONs,表明UFH-SPIONs粒径较为均一;UFH-SPIONs的Zeta电位绝对值明显高于SPIONs,表明UFH-SPIONs稳定性更高。1.4 UFH-SPIONs红外光谱表征利用傅里叶变换红外光谱仪在波长为2000～600cm-1范围内对SPIONs和UFH-SPIONs扫描并记录红外光谱图,表明UFH已经成功修饰在SPIONs表面。1.5 UFH-SPIONs铁离子含量测定采用邻菲啰啉分光光度法对SPIONs和UFH-SPIONs的铁离子浓度进行测定。UFH-SPIONs样品中铁离子浓度在100～180μg/mL之间,SPIONs铁离子浓度为25μg/mL左右。1.6 UFH-SPIONs肝素含量测定采用甲苯胺蓝法对UFH-SPIONs样品中肝素浓度进行了测定,肝素含量在233.37～291.72μg/g 之间。2.UFH-SPIONs的初步稳定性评价将制备的SPIONs和UFH-SPIONs样品溶液放置于4℃,在不同时间点观察样品溶液分层沉降情况。SPIONs样品在1周内就出现聚集沉淀的现象;而UFH-SPIONs样品在1个月内未出现明显外观变化,表明SPIONs经UFH修饰稳定性显著提高。3.UFH-SPIONs类酶活性测定采用邻苯三酚法测定SPIONs及UFH-SPIONs的类SOD活性;以过氧化物酶（Peroxidase,POD）经典反应底物 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine,TMB）来测定二者POD活性;通过使用荧光吸收光谱检测UFH-SPIONs对H2O2的催化分解来评估类CAT活性。结果显示,SPIONs及UFH-SPIONs都具备拟SOD、POD和CAT催化活性;同等铁离子浓度下,UFH-SPIONs的类酶活力高于SPIONs,且类酶活性与铁离子浓度呈正相关。4.小鼠海马神经元细胞毒性测定采用CCK-8法检测UFH-SPIONs对小鼠海马神经元细胞的影响,结果显示UFH-SPIONs对小鼠海马神经元细胞没有毒性,还显示出明显的促增殖作用（P＜0.01）。5.UFH-SPIONs外周给药后在脑组织致癫灶分布情况复制锂-匹罗卡品颞叶癫痫模型,经尾静脉注射UFH-SPIONs 4h后采用核磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）进行颅脑扫描。结果显示,UFH-SPIONs经尾静脉注射后可以跨越正常大鼠以及癫痫模型大鼠的BBB进入大脑,且在海马体致癫灶富集。取上述动物的海马组织切片并进行普鲁士蓝染色,结果显示,经尾静脉注射,UFH-SPIONs在正常大鼠和癫痫模型大鼠海马组织中均有分布,且癫痫模型大鼠穿透BBB效率更高。6.UFH-SPIONs抗颞叶癫痫有效性评价6.1癫痫模型大鼠行为学考察采用锂-匹罗卡品方法复制颞叶癫痫大鼠模型。结果发现,与模型组相比,UFH-SPIONs高剂量组和低剂量组的癫痫潜伏期和达到大发作等级的时间均显著延长（P＜0.05）;其中高剂量组的癫痫发作等级相较于模型组明显减轻（P＜0.05）,表明UFH-SPIONs对癫痫大鼠癫痫发作有显著的抑制作用。6.2海马神经元损伤观察大鼠海马组织切片的尼氏染色结果显示,癫痫模型组海马组织出现大量形态异常神经元,细胞排列紊乱,胞核与胞浆分界不清;与模型组相比,阳性药物左乙拉西坦组和UFH-SPIONs高剂量和低剂量组海马组织损伤以及神经元缺失情况均有不同程度改善。对各组大鼠海马组织神经元统计分析发现,与正常组相比,模型组海马神经元存活数显著减少（P＜0.01）;相较于模型组,UFH-SPIONs高剂量组和阳性对照组海马神经元存活数显著增加,（P＜0.01）;UFH-SPIONs低剂量组海马神经元存活量也表现出明显升高（P＜0.05）。HE染色结果显示,癫痫模型组大鼠海马组织细胞肿胀,轮廓分布不均匀,出现细胞数量减少,细胞核破碎等情况;与模型组相比,阳性药物左乙拉西坦组和UFH-SPIONs高剂量和低剂量组海马神经元损伤程度呈不同程度减轻;高剂量组神经元形态规则,排列整齐,膜仁边界清晰,效果优于低剂量组。综上表明,UFH-SPIONs对癫痫大鼠神经元损伤有保护作用。7.UFH-SPIONs抗颞叶癫痫作用机制研究7.1神经炎症采用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素（Interleukin-1β,IL-1β）和白细胞介素（Interleukin-6,IL-6）的含量;利用免疫组化检测海马组织核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）、高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein,HMGB1）的表达情况。结果表明,相比正常对照组,癫痫模型组大鼠海马组织中IL-6、IL-1 β、TNF-α含量与NF-κB、HMGB1表达量均显著升高（P＜0.01）;与癫痫模型组相比,阳性药物左乙拉西坦组、UFH-SPIONs 高、低剂量组 IL-6、IL-1β、TNF-α水平与 NF-κB、HMGB1 表达量均明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。这些结果表明,UFH-SPIONs对癫痫大鼠海马组织炎症因子水平有显著的降低作用。7.2氧化应激采用黄嘌呤氧化法和钼酸铵法分别检测大脑海马组织中SOD、CAT活性,硫代巴比妥酸法检测丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量,免疫组化检测海马组织神经型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,NOS1）表达情况。结果发现,模型组大鼠海马组织中SOD和CAT活性显著降低（P＜0.01）,同时MDA含量与NOS1表达量显著增加（P＜0.01）;与模型组相比,阳性对照组、UFH-SPIONs高剂量组SOD和CAT活力明显提升,MDA含量与NOS 1表达水平也明显下降（P＜0.01或P＜0.05）,UFH-SPIONs低剂量组CAT活性明显升高,MDA含量明显降低（P＜0.05）,而SOD活性和NOS1表达量无显著性差异（P＞0.05）。这些结果表明,UFH-SPIONs对癫痫大鼠海马组织抗氧化酶活性有升高作用,能够抑制氧化应激水平。7.3神经元凋亡采用免疫组化法检测各组海马组织天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3）、BCL2-相关 X 蛋白质（BCL2-Associated X,BAX）表达情况。相比正常对照组,模型组大鼠海马组织中Caspase-3和BAX的表达量显著上升（P＜0.01）;与模型组相比,阳性对照组以及UFH-SPIONs高低剂量组大鼠海马组织中Caspase-3和BAX表达量明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。这些结果表明,UFH-SPIONs对癫痫大鼠神经元凋亡有抑制作用。总之,本课题采用UFH对SPIONs进行修饰,获得了稳定、均一且具有类抗氧化酶活性的UFH-SPIONs,并证实UFH-SPIONs能够跨越癫痫大鼠的BBB,富集于癫痫致病灶,通过抑制癫痫过程中的氧化应激与神经炎症发挥神经保护作用,显著减轻癫痫的大发作以及所导致的海马组织损伤以及神经元缺失情况。以上结果提示,UFH-SPIONs值得作为抗癫痫的新药继续深入研究。