喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤,其发病率目前有明显增长趋势,占全身恶性肿瘤的5.7%一7.6%[1],发病机理目前仍存在许多假说,一般认为与吸烟、饮酒、空气污染、病毒感染和性激素及受体有关。虽然近年随着微创手术、放疗、化疗、同步放化疗及生物治疗等综合性治疗措施改进以及共同应用,已使患者的生存时间及生活质量有所提高，但喉癌的复发、转移及对放化疗不敏感常使治疗效果欠佳。越来越多的研究表明，这可能与肿瘤干细胞有关。肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）学说认为:肿瘤组织中存在极少量充当干细胞角色的肿瘤细胞,它们具有自我更新和多向分化潜能,在肿瘤的形成和生长中起着重要作用,是肿瘤生长、转移和复发的根源。侧群细胞（sidepopulation，SP）分析法作为肿瘤干细胞分离鉴定的一种方法，主要是利用干细胞能够将荧光染料H oechst33342外排的特性,经过紫外激发后用双波长(450nm和675nm以上波长)监测,可以观察到这群细胞发出微弱的蓝色和红色荧光,在流式二维分析点阵图上,呈彗星状分布在阳性染色的主群(main population,MP或者non-SP)细胞的一侧[1,2]。第一部分喉癌侧群细胞分选的条件优化【目的】探讨喉癌细胞株Hep-2中侧群细胞（side population，SP）分选的优化条件。【方法】取对数生长期的Hep-2细胞，予胰酶消化后，用含2%胎牛血清1640培养基制成1×106个/ml单细胞悬液。①实验组喉癌细胞悬液中加入Hoechst33342至终浓度分别为5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml，于37℃中孵育90min。②取单细胞悬液，分别于37°水浴中孵育Hoechst50、70、90、110、130min。③实验组喉癌细胞悬液加入Hoechst后，分别孵育于37°水浴及37°恒温箱中。两组保持Hoechst浓度及细胞密度一致。④取汇合度分别为100%、70%的两瓶细胞，同上制成单细胞悬液。分别加入相同浓度的Hoechst，并于37°水浴。染色结束于冰上终止染色5min后，离心，去上清，加入PBS重悬细胞，且均于上机前5min加入碘化丙啶（PI）至1μg/ml，后上流式细胞仪进行检测鉴定。以上各组均设阴性组于Hoechst染色前加维拉帕米，至终浓度为150μmol/ml，并于37℃中孵育30min后，其他各条件保持与相应实验组一致。【结果】①当Hoechst33342浓度分别为5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml时，SP%分别为（39.96±0.240）%、（26.23±0.385）%、（18.79±0.023）%、（19.01±0.138）%，死细胞比例分别为（30.45±0.634)%、(49.9±0.42)%、(50.12±0.68)%、(64.16±0.387)%。②Hoechst在37°水浴中孵育90min时，流式细胞图形最典型，SP%为(17.37±1.423）%；③孵育于37°水浴较孵育恒温箱中，实验组未被Hoechst33342标记的细胞分别为（18.67±0.448）%、（22.6±0.497）%；④汇合度90%以上较汇合度70%的细胞，SP%由（19.075±0.464)%降到（16.073±0.519)%。以上结果均经SPSS16.0分析，p<0.05，差别有统计学意义。【结论】在流式细胞仪分选喉癌Hep-2侧群细胞中Hoechst33342的最佳浓度为10μg/ml，最佳孵育时间为90min，且水浴优于恒温箱中孵育，细胞密度最好选择80-90%之间。第二部分喉癌侧群细胞的分选及其体外生物学特性【目的】探讨喉癌细胞株Hep-2中干细胞样侧群细胞（side population,SP）的分选方法及侧群细胞的干细胞特性。【方法】制备喉癌Hep-2单细胞悬液，经Hoechst33342染色后，用荧光激活细胞分选技术分选出人喉癌侧群和非侧群(non-SP,NSP)细胞，测定SP细胞亚群所占的比例。电子显微镜下观察SP及NSP细胞形态，检测两群细胞的细胞周期、CCK8检测细胞的增殖能力。荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测SP及NSP细胞中的ABCG2mRNA的相对量，结果用2-Δ(ΔCt)计算。【结果】流式细胞仪分析结果表明，SP细胞在Hep-2细胞株中占(13.17±1.85)％.生长曲线（CCK8法）示，SP细胞较NSP细胞有更强的增殖能力；两者所处的细胞周期相似，S期细胞比例及增殖指数(proliferation index，PI）两者相比，t分别为0．678、0．614(p<0.05)。RT-PCR示SP中ABCG2mRNA含量高于NSP。【结论】人Hep-2细胞株中存在一部分能将Hoechst33342排出的侧群细胞。SP细胞较NSP有更强的体外增殖能力，具有干细胞活性。SP细胞中ABCG2mRNA表达量明显高于NSP细胞。第三部分顺铂在喉癌非侧群细胞转化为干细胞样肿瘤细胞中作用的探讨【目的】探讨喉癌细胞株Hep2经流式分选后的非侧群细胞经化疗药物诱导转变为干细胞样肿瘤细胞的可能机制。【方法】喉癌Hep2细胞株经流式细胞仪荧光活化细胞分选系统（fluorescence-actived cell sortin,FACS）分选后，获得的非侧群待贴壁80%后分别加入顺铂（实验组）和生理盐水(对照组)培养48h，再次上流式细胞仪检测两组侧群细胞比例;并通过荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）及western blot分别在mRNA和蛋白水平检测两组细胞的干细胞样标记β-catenin、notch-1的基因和蛋白的表达情况。【结果】实验组非侧群细胞经顺铂（终浓度1ug/ml）作用48h后，侧群细胞比例为(17.16±0.18)%，对照组则为(10.05±1.20)%，两者差异有统计学意义（t=5.844，P=0.004）。荧光定量RT-PCR示经顺铂处理实验组的β-catenin、notch-1mRNA较对照组显著增多；western blot示实验组细胞中β-catenin、notch-1蛋白表达量较对照组显著增加(t=5.155，P=0.031；t=5.977，P=0.004）。【结论】非侧群细胞经化疗药物顺铂诱导后可分化为干细胞样肿瘤细胞。其可能机制是通过wnt/β-catenin、notch转导通路异常诱导非侧群细胞转化为干细胞样肿瘤细胞。