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胃癌（Gastric Cancer GC）是发生在胃上皮组织的恶性肿瘤,具有发病率高,转移率高,死亡率高的特点。传统的抗肿瘤和靶向治疗对预后有轻微改善,但对转移及进展期患者无明显改善。通过监测肿瘤相关miRNA、靶蛋白及基因组相关转移基因,可作为治疗胃癌的新突破点。南蛇藤（Celastrus orbiculatus thumb.）为卫矛科南蛇藤属植物,药性辛温,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、杀菌等活性作用。在南蛇藤总萜的基础上,本实验室成功地分离出多种萜类化合物的单体成分。通过改进提取工艺,对新分离的单体成分进行药敏实验,发现28-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-29-oic Acid生物活性较强,因此选择该组分进行进一步研究。miRNA是一种公认的新肿瘤标志物。有研究显示,高表达miR-451后,胃癌细胞周期停滞于G0/G1期;而抑制miR-451的表达后,则促进胃癌细胞分裂。由此,推测miR-451在胃癌中扮演着抑癌基因的角色。课题组前期发现,胃癌手术样本中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR）的表达量明显增加。本研究首先分析了miR-451和mTOR在胃癌组织中的表达量与胃癌临床病理特征的关系。然后,构建过表达miR-451的人胃癌AGS细胞株（记作AGS/miR-451+）,研究28-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-29-oic Acid对人胃癌AGS/miR-451+细胞增殖、凋亡和转移的影响,并对其分子作用机制进行初步探讨,为胃癌的临床治疗寻找新的靶点药物提供科学理论依据。主要研究内容分为三个部分。第一部分miR-451和mTOR在胃癌组织中的表达及与临床病理特征的关系目的:检测胃癌组织中miR-451和mTOR的表达及与临床病理特征的关系。方法:收集20对来自扬州大学附属医院的胃癌手术样本,记录其临床病理特征。PCR检测样本中miR-451（miR-451a和miR-451b）的表达,免疫组化检测样本中mTOR的阳性率,并分析miR-451和mTOR与临床病理特征的关系。结果:样本中miR-451a、miR-451b的表达量分别是癌旁组织的10.4%、43.8%,mTOR的阳性表达率为90%,miR-451和mTOR的表达与临床病理特征相关。结果表明,组织样本中miR-451的表达量显著降低,mTOR在胃癌组织样本中呈阳性表达,miR-451和mTOR的表达均与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关。结论:miR-451在人胃癌组织中表达降低,mTOR的阳性表达率高,miR-451和mTOR的表达均与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关,而与患者年龄、性别和肿瘤直径无关。第二部分 构建过表达miR-451的人胃癌AGS细胞目的:构建稳定过表达miR-451的人胃癌AGS细胞株。方法:利用改良型慢病毒小RNA表达载体pTRIPZ（Open Biosystems）,以分子克隆的方法,构建的重组质粒pTRIPZ-miR-451与两种辅助包装质粒,以Lipofectamine 2000法共转染293 T细胞,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液,测定并标记病毒滴度。病毒感染对数期人胃癌AGS细胞后,嘌呤霉素筛选阳性细胞。DOX诱导后,倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化以及荧光表达情况。结果:DOX诱导后,表达红色荧光者即为过表达miR-451的人胃癌AGS/miR-451+细胞。相比对照组细胞,细胞形态无显著差异,红色荧光信号明显增强,感染效率约90%。DOX浓度为100 ng/mL时,miR-451的表达强度最高。结论:成功构建稳定高表达miR-451的人胃癌AGS/miR-451+细胞。第三部分 28-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-29-oic Acid抑制人AGS/miR-451+细胞转移的作用机制目的:探索南蛇藤提取物2 8-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-2 9-oic Acid抑制人 AGS/miR-4 51+细胞生长及转移的分子机制。方法:MTT法检测不同浓度28-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-29-oic Acid对人AGS/miR-451+细胞增殖能力的影响。划痕实验检测药物对细胞迁移能力的影响。Western blot法分析对凋亡及mTOR相关蛋白的影响。结果:28-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-29-oic Acid明显抑制人胃癌AGS/miR451+细胞的增殖（P<0.05）,具有时间及浓度依赖性。划痕实验结果显示,该药物具有明显抑制AGS/miR451+细胞迁移的能力。Western blot结果显示,mTOR、PI3K、AKT、pAKT、4EBP1等蛋白的表达量明显减低（P<0.05）,并呈浓度依赖性。凋亡通路相关蛋白,随着药物浓度的增加,Bax、Caspase-1、Caspase-3、Cyt-c的表达上调,Bcl-2/Bax比值减小,具浓度依赖性。结论:28-Hydroxy-3-oxoolean-12-en-29-oic Acid 明显抑制人胃癌AGS/miR451+细胞的增殖与侵袭转移,其分子机制与PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关。