【摘 要】
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慢性病毒性乙型肝炎感染的发病率在过去二十年一直呈稳步上升趋势。乙型肝炎病毒（HBV）感染依旧是主要的公共疾病,对于慢性乙型肝炎的治疗,核苷酸或核苷类似物等能有效控制病毒复制,但很少能永久治愈。此外很大一部分HBV感染者会发展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。HBV的罪魁祸首为病毒的共价闭合环状DNA（ccc DNA）。本研究首先通过HBV全基因组分析,选定了TALEN（第二代基因编辑技术）攻击的基因组
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慢性病毒性乙型肝炎感染的发病率在过去二十年一直呈稳步上升趋势。乙型肝炎病毒（HBV）感染依旧是主要的公共疾病,对于慢性乙型肝炎的治疗,核苷酸或核苷类似物等能有效控制病毒复制,但很少能永久治愈。此外很大一部分HBV感染者会发展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。HBV的罪魁祸首为病毒的共价闭合环状DNA（ccc DNA）。本研究首先通过HBV全基因组分析,选定了TALEN（第二代基因编辑技术）攻击的基因组位点,然后利用Golden Gate方法组装TALEN模块序列,通过限制性内切酶和连接酶将每个模块DNA序列从载体质粒中取下,并按设计顺序进行一部克隆连接成目标模块序列,经多步筛选,选出成功的克隆,最后加以测序验证。之后利用分子克隆技术,如核酸定点突变技术,将原TALEN骨架中某特定碱基突变,但保留其原有功能;酶切酶连使改造过的TALEN骨架片段转移至pc DNA3.1-IRES-Ds RED2-Puro和pc DNA3.1-IRES-EGFP-Puro等操作,成功构建了适用于在哺乳动物细胞表达和筛选的TALEN骨架载体pc DNA3.1-TAL-IRES-Ds RED2-Puro和pc DNA3.1-TAL-IRES-EGFP-Puro。之后又将构建好的TALEN模块序列转移至pc DNA3.1-TAL-IRES-Ds RED2-Puro或pc DNA3.1-TAL-IRES-EGFP-Puro载体中,经筛选和测序验证,从而得到了适用于在哺乳动物细胞表达和筛选的并且能够攻击HBV基因组特定位点的TALEN的表达载体,为今后进一步功能测试和开发靶向HBV基因组药物打下基础。
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