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第一部分 大鼠宫腔粘连模型的建立与稳定性评估目的:制备稳定的实验性宫腔粘连(IUAs)大鼠模型。方法:1选取36只动情期SD大鼠进行造模,分为三组,每组12只:(1)化学损伤组:0.5ml95%乙醇分别灌注双侧宫角5min后吸出。(2)双重损伤组:微型刮匙搔刮两侧宫角,后将细菌脂多糖(LPS)棉线置于宫腔内。(3)假手术组:仅行开关腹手术。2在术后7d,14d,21d分别处死各组SD大鼠4只,取材子宫,并通过HE及Masson染色,测量其子宫内膜的腺体数量、厚度及纤维化面积,免疫组织化学法检测MMP-9和VEGF在SD大鼠子宫内膜中的表达水平。结果:1.HE染色和Masson染色:(1)化学损伤组:损伤7 d时,细胞破裂失去正常形态,伴见部分组织出现纤维增生粘连带;损伤14d及21d时,可观察到宫腔组织呈修复趋势。(2)双重损伤组:模型制备7d后,可见内膜上皮线完整性受损,伴见组织剥脱,碎片散落于体积缩小的宫腔内,粘连带出现,并见增生现象,损伤14d及21d时,内膜镜下与7d无明显差异,仅表现为纤维程度进行性加重,宫腔体积持续缩小且其内可见粘连带面积增加。2.病理形态学指标:(1)腺体个数:造模7d后和造模14天后,均发现假手术组腺体个数多于化学损伤组和双重损伤组,造模21d后,化学损伤组和假手术组腺体个数多于双重损伤组。(2)子宫内膜厚度:造模后7d,造模后14d,造模后21d时,均发现假手术组内膜厚度厚于化学损伤组和双重损伤组。(3)纤维化面积:造模后7d,造模后14d,造模后21d时,均发现双重损伤组纤维化程度重于化学损伤组和假手术组。3.MMP9表达:造模后7d和造模后14d时,假手术组表达显著于化学损伤组和双重损伤组;造模后21d时,假手术组和化学损伤组表达显著于双重损伤组。4.VEGF表达:造模后7d时,化学损伤组和双重损伤组显著表达多于假手术组,同时,双重损伤组多于化学损伤组;造模后14d和造模后21d时,均为化学损伤组和双重损伤组表达显著于假手术组。结论:1 95%乙醇及刮宫+LPS感染两种造模方法均可损伤子宫内膜造成宫腔粘连。2机械+感染因素所致的双重损伤方法建造的模型具有更高的稳定性,亦更贴近宫腔粘连的临床表现,因此成为后续补肾活血方与骨髓间充质干细胞治疗宫腔粘连的理想动物模型。第二部分补肾活血方联合BMSCs治疗IUAs的疗效评价目的:研究补肾活血方联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)原位移植对于宫腔粘连SD大鼠子宫内膜的影响。方法:1选取50只SD雌鼠基于第一部分稳定性高的双重损伤法造模,造模7天后实施不同治疗方案。2治疗方案分组:(1)模型组:造模7天后,连续灌胃生理盐水2ml15天;(2)补佳乐组:造模7天后,连续灌胃补佳乐混悬液2ml15天;(3)补肾活血组(BSHX组):造模7天后,连续灌胃BSHX方混悬液2ml15天;(4)骨髓间充质干细胞组(BMSCs组):造模7天后,连续灌胃生理盐水2ml天,第10天时,麻醉后开腹沿宫角纵轴肌壁间注射BMSCs混悬液1ml;(5)中药+BMSCs组:造模7天后,连续灌胃BSHX方混悬液2ml15天,于灌胃第10天,麻醉后开腹沿宫角纵轴肌壁间注射BMSCs混悬液1ml。并于治疗结束后的第5天将所有雌鼠与雄鼠以3:1的比例合笼,受精后7d处死所有老鼠取子宫标本。3子宫标本进行以下检测:(1)HE染色法,记录各组子宫形态及腺体数量,测量内膜厚度。Masson染色法,测量各组内膜纤维化程度。(2)PCR检测MMP-9、VEGF水平的表达。(3)免疫组织化学检测MMP-9、VEGF的表达。(4)记录各组子宫妊娠数量。结果:1病理形态学变化:(1)HE染色和Masson染色:模型组的内膜、宫腔等变化同第一部分所述内容相似,而治疗组均可见内膜修复现象,其中以补佳乐组和补肾活血组(BSHX组)改善最为明显,骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)组的改善最微弱。(2)腺体个数:补肾活血组(BSHX组)、骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组多于补佳乐组,骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组少于补肾活血组(BSHX组),同时,骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)少于中药+BMSCs组;(3)内膜厚度:治疗组最终测量结果皆较模型组为厚,骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组小于补佳乐组和补肾活血组(BSHX组)。(4)纤维化面积:补佳乐组、骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)及中药+BMSCs组均大于补肾活血组(BSHX组);补佳乐组和中药+BMSCs组均小于骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)。2 PCR结果(1)MMP-9表达:补佳乐组高于骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组;骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组低于补肾活血组(BSHX组),同时骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)低于中药+BMSCs组。(2)VEGF表达:骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)高于补佳乐组、补肾活血组(BSHX组)和中药+BMSCs组。3免疫组化结果(1)MMP-9表达:补肾活血组(BSHX组)、骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组明显低于补佳乐组;骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)低于中药+BMSCs组和补肾活血组(BSHX组)。(2)VEGF表达:骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组高于补佳乐组;补佳乐组、骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)和中药+BMSCs组均高于补肾活血组(BSHX组);骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)高于中药+BMSCs组。4子宫角妊娠数量补肾活血组(BSHX组)和中药+BMSCs组多于补佳乐组;骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)少于补佳乐组、补肾活血组(BSHX组)和中药+BMSCs组。结论:1 BSHX方灌胃联合BMSCs移植的治疗方法,可一定程度改善子宫内膜的厚度,促进内膜腺体再生,提高妊娠率,其综合效果与单独使用BSHX方灌胃差异不大。2补肾活血方可改善子宫内膜粘连情况,减少纤维化增生,刺激子宫内膜增厚,增强内膜容受性,最终提高妊娠率。3 BMSCs原位移植方法对于子宫内膜的改善无显著作用。可能由于子宫肌壁间注射的移植方式对内膜再次造成损伤,致其综合疗效欠佳。