Bmi-1(B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1)基因为一种属于PcG(Polycomb group)家族成员的致癌基因，1991年在鼠淋巴瘤中被发现，BMI-1蛋白也与果蝇PSC和SU(Z)2蛋白相似，其氨基端为指环结构域，具有转录调节作用；中间部分为螺旋-转角-螺旋-转角(helix turn helix turn，H-T-H-T)结构，是DNA结合域，并与转录抑制有关：羧基端为PEST序列，与BMI-1在细胞内快速降解有关[1]。人Bmi-1基因定位于10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关)，DNA大小为4.9 kb，mRNA为3199 bp，含10个外显子，编码含326个氨基酸的蛋白质，分子质量为36.9KD。 Bmi-1参与干细胞的增殖、分化与衰老[2、3、4、5、6]，与肿瘤的发生[7、8、9、10、11]，肿瘤干细胞关系密切[4,12,13]，也可以引起细胞永生化[14、15、16、17、18,19,20],Bmi-1的一个主要作用位点是INK4a，该位点可以编码抑癌蛋白p16INK4a和p19ARF(人为p14ARF)，Bmi-1负性调控p16INK4A和P19ARF的表达，通过p16／细胞周期素(cyclin)D／Rb和p19／MDM2／p53通路来调节细胞的增殖和衰老[21,22]。Bmi-1能够延长人成纤维细胞的生存期却不能使其永生化[38]；而过表达Bmi-1可以使p16INK4a正常表达的鼻咽上皮细胞绕过老化，发生永生化，在鼻咽上皮细胞中，Bmi-1使端粒酶的活性增强，p16INK4A的表达降低从而发生永生化[19]；亦有Bmi-1诱导乳腺上皮细胞永生化的报道，但是是建立在乳腺上皮细胞经过自我筛选后p16INK4A不表达的基础上的，Bmi-1使这些p16INK4A表达缺失的乳腺上皮细胞端粒酶活性增强，发生永生化[20]。Bmi-1能否使p16INK4a正常表达的乳腺上皮细胞发生永生化还未见有报道。Bmi-1能激活包括乳腺上皮细胞在内的正常上皮细胞端粒酶活性[18,19,20]，能够使p16INK4A的表达降低[18,19]。在乳腺正常上皮细胞中，Bmi-1能否降低p16INK4A的表达?又是通过怎样的机制来阻抑p16INK4A的表达呢? DNA甲基化是基冈沉默的一种方式，是较早发现的基冈表观修饰方式之一，可能存在于包括哺乳动物在内的所有高等牛物中。研究证明抑癌基因甲基化与肿瘤的发牛关系密切[23,24,25,26]。DNA甲基化是人类后成论学说的丰要复制后修饰方式．它通常发生在胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基上。多种基冈的启动子区和第一外显子富含CpG[29]，而CpG相对集中的区域称为CpG岛[27]。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化[27]，在生理情况下，CpG岛多为非甲基化的。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达[30]。DNA甲基化不仅在胚胎发育和细胞分化过程中起着关键作用，而且在癌变过程中扮演着重要角色。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达[31]。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高，例如：胰岛素样生长因子-2(IGF-2)基因印记丢失导致多种肿瘤，如Wilms瘤[32]。目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因失活有关[33]。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测[34]，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著[35]。 研究内容和实验方法： 收集非癌乳腺活检组织(女性)，进行原代组织培养，建立正常乳腺上皮细胞，用Bmi-1诱导p16INK4a正常表达的乳腺上皮细胞发生永生化。在永生化乳腺上皮细胞株建立的基础上研究Bmi-1引起细胞永生化的可能机制。 细胞免疫组化：角蛋白染色证实所培养上皮细胞为上皮来源； 永生化细胞株的建立：乳腺上皮细胞感染pMSCV-Bmi-1以诱导其永生化，另外感染pMSCV作为对照；Western blot检测Bmi-1感染进细胞后，持续培养观察细胞的生存期。 RT-PCR检测转录水平的表达：采用RT-PCR的方法检测．Bmi-1通路中Gbx2，MKI67，CCNB1，BUB1，HEC，KIAA1063，HCFC1，RNF2，ANK3，FGFR2，CES在转录水平的表达。以明确Bmi-1感染进细胞后是否会引起变化。 Western Blotting：在翻译水平检测p53，pRB通路各蛋白以及BMI-1，hTERT等蛋白的表达水平； 端粒酶活性测定：判断细胞永牛化的标志性实验之一，检测Bmi-1感染进细胞后引起端粒酶活性的变化。 倍增曲线分析：分析细胞倍增速率，倍增倍数； MSP法进行甲基化检测：提取细胞BN6-BMI-1及BN6-pMSCV的DNA，用亚硫酸氢钠处理后，采用MSP法分析甲基化情况； 实验结果： 1.原代培养建立乳腺正常上皮细胞从手术室取非肿瘤病人乳腺组织，病理检测结果为正常乳腺组织，将新鲜标本经无血清培养液冲洗2次，剪成1mm3大小后种植于25cm培养瓶中进行培养，三天后可见到细胞从组织块中长出，细胞小，活性好，呈梭形，贴壁生长，存在接触抑制，未见重叠生长，命名为BN6。待细胞长满培养瓶底后，胰酶消化传代，4-6天传代一次，细胞传到第6代左右时(大约12个CPDs)，开始出现衰老死亡，细胞体积变大，活性降低，形态不规则，细胞数不再增加，逐渐死亡。细胞角蛋白染色显示细胞BN6来自上皮细胞。Western blot分析CD-10，claudin-4及p16的表达情况证实细胞来自乳腺腺泡上皮细胞，其p161NK4a表达为阳性。 2.Bmi-1感染BN6建立永生化细胞株BN6-BMI-1. 制作逆转录病毒pMSCV-Bmi-1和pMSCV，用逆转录病毒pMSCV-Bmi-1和pMSCV感染细胞BN6，感染后的细胞用含有0.5ug／ml puromycin的培养基筛选3-5天。Western blot分析证明Bmi-1成功感染进细胞。光镜下细胞折光性增强，活性增强，形态未发生明显变化，细胞能越过危险期持续生长超过100个倍增周期。 3.Bmi-1使细胞BN6永生化的机制Bmi-1能够诱导筛选后的人乳腺上皮细胞端粒酶活性，也能够诱导鼻咽上皮细胞端粒酶活性，我们想知道Bmi-1是否能够激活未发生筛选p16阳性的乳腺上皮细胞的端粒酶活性，我们检测了Bmi-1过表达细胞BN6-BMI-1和对照细胞BN6-pMSCV中端粒酶的表达水平和端粒酶活性，结果在BN6-BMI-l细胞中端粒酶的表达和活性明显增高。为了进一步研究Bmi-1永生化乳腺上皮细胞BN6的可能机制，我们分析了Rb和p16信号通路，与对照细胞BN6-pMSCV相比，随着传代的增加，BN6-BMI-1细胞p16的表达逐渐降低，直至消失，Western blot检测显示BN6-BMI-1细胞中p16的表达在第10代之后消失，pRB的磷酸化水平有所增强，而P53等蛋白的表达未见明显变化，提示p16／Rb信号通路的异常可能在Bmi-1诱导乳腺上皮细胞用升华的过程中起重要作用，所以Bmi-1使细胞BN6永生化的可能机制是：Bmi-1通过某种机制使细胞中p16的表达下调，从而使pRB的磷酸化水平增强，促进了细胞的生长和增殖，同时h-TERT在细胞BN6-BMI-1中的表达增强，端粒酶活性增强，细胞越过衰老凋亡，达到永生化。那么Bmi-1通过什么样的机制引起p16表达下调的呢?已有研究证明多梳基因家族包括Bmi-1可能与DNA甲基化转移酶机制相关联，是否在乳腺细胞中Bmi-1可诱导p16启动区域的GpC岛的甲基化从而使p16的表达下调直至表达沉默?于是提取BN6-PMSCV及BN6-BMI-1细胞的基因组DNA，采用MSP法检测p16的甲基化情况，结果显示BN6-BMI-1中p16发生了甲基化，而对照细胞BN6-pMSCV未发生p16的甲基化。所以其可能机制为Bmi-1与甲基转移酶相互作用促使了p16的甲基化，使p16的表达沉默，磷酸化的Rb水平增高，p16／Rb信号通路发生异常导致细胞发生了早期转化达到永牛化。实验结论： 1.由单基因Bmi-1成功诱导了p16阳性的乳腺上皮细胞发生永生化，建立了永生化上皮细胞株BN6-BMI-1。 2.初步探讨了Bmi-1引起细胞BN6永生化的可能机制：Bmi-1促进p16发牛甲基化，从而使p16表达沉默，同时伴有细胞端粒酶的激活，以致发生永生化。