【摘 要】
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目的:通过在纳米氧化铝颗粒（ANs）表面吸附干扰素基因刺激因子（STING）的天然激动剂c GAMP构建一种新型疫苗佐剂—传递系统（VADS）,明确其作为VADS的安全性和抗原递送能力,利用重组SARS-Co V-2病毒S蛋白受体结构域（RBD）作为模型抗原建立一种新型COVID-19疫苗候选配方,并考察了其在小鼠体内的免疫效力以及作为黏膜佐剂的潜力。方法:（1）通过吸附作用制备ANs-GAMP,
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目的:通过在纳米氧化铝颗粒（ANs）表面吸附干扰素基因刺激因子（STING）的天然激动剂c GAMP构建一种新型疫苗佐剂—传递系统（VADS）,明确其作为VADS的安全性和抗原递送能力,利用重组SARS-Co V-2病毒S蛋白受体结构域（RBD）作为模型抗原建立一种新型COVID-19疫苗候选配方,并考察了其在小鼠体内的免疫效力以及作为黏膜佐剂的潜力。方法:（1）通过吸附作用制备ANs-GAMP,使用动态光散射粒度分析仪观察其粒度分布和ζ电位,透射电镜观察其形貌粒径;采用考马斯亮蓝蛋白测定法,检测其抗原装载效率和体外释放情况;通过MTT法评价其细胞相容性;通过流式细胞术（FACS）和激光共聚焦成像（LSCM）观察抗原提呈细胞（APC）对其的摄取情况;在相关抑制剂存在下通过FACS研究其细胞摄取途径及影响因素;通过LSCM观察其是否发生溶酶体逃逸。（2）通过肌肉注射和肺部吸入两种途径,分别给予昆明小鼠RBD,ANs-RBD,ANs-GAMP-RBD不同的疫苗配方,给予生理盐水组作为阴性对照,肌肉注射磷酸铝（AMs-RBD）组作为阳性对照,在第一次接种五周后进行二次接种,免疫后每周采用眼眶取血收集小鼠血清,ELISA法检测血清中抗体水平及滴度以及相关细胞因子水平;每次免疫三周后分别收集口腔冲洗液、鼻腔冲洗液、阴道冲洗液、粪便上清液以及肺泡灌洗液,ELISA法检测这些黏膜部位Ig A水平;二次免疫三周后无菌提取脾细胞,采用FACS检测脾细胞分型,MTT法检测脾细胞增殖。结果:（1）ANs-GAMP粒径分布较为均一,约为30 nm,ζ电位为-29 mv,形态为近球形;MTT实验结果表明即使在较高浓度,也未表现出明显的细胞毒性。与阳性对照磷酸铝相比,ANs-GAMP显著地增加了APC的摄取,且更有效的刺激APC表面CD40、CD86的表达。ANs-GAMP通过多种途径被APC摄取,包括大胞饮,网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞,且成功产生了溶酶体逃逸。（2）经肌注或肺部吸入两种途径一次免疫后,成功在ANs-GAMP组小鼠血清中检测到较高的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平,IgG滴度在免疫后28天达到最高峰,而传统佐剂AMs则在二次接种后才能检测到相应的抗体。ANs-GAMP组在二次免疫后的IgG水平显著增高,在第二周IgG滴度达到最高,达到4×10~5,第三周IgG1、IgG2a滴度达到2×10~5,血清和脾细胞上清液中都检测到较高水平的IFN-γ、IL-4。此外,在经肺部吸入免疫ANs-GAMP-RBD的小鼠相关黏膜部位尤其是肺泡灌洗液和阴道冲洗液中成功检测到较高的IgA水平。脾细胞分型实验中,ANs-GAMP组显著增加了CD8+、CD4+T细胞分型,分泌IFN-γ的活化CD8+T细胞数也显著提高。结论:ANs-GAMP具有作为一种优良VADS的潜力,经一次免疫就成功诱导机体产生针对所载抗原RBD的特异性免疫反应,这对于新冠病毒的早期保护具有重要意义。更重要的是,ANs-GAMP能够诱导混合的、强烈的、更加平衡的Th1/Th2反应,其中Th1反应对于保护机体免受病毒感染以及清除病毒和感染细胞是必不可少的。另外,ANs-GAMP经肺部黏膜免疫成功在接种部位及远端部位诱导抗原特异性的Ig A反应。因此,我们的发现强调了ANs-GAMP作为一种安全有效、易大量生产的COVID-19通用VADS的潜力,并为发展肺黏膜疫苗接种策略提供了理论依据。
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