非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种出血性传染性疾病,致使家猪死亡率高达100%,对全球养猪业造成经济损失和严重威胁。CD2v蛋白是ASFV重要的致病因子和保护性蛋白,是非洲猪瘟疫苗设计和免疫检测的靶蛋白之一。本研究在HEK293F细胞中实现重组CD2v蛋白的分泌性表达和糖基化修饰,以纯化的重组CD2v蛋白作为免疫原,筛选并表征高效价、高亲和活性的单克隆抗体。1.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的真核表达与纯化选取ASFV SY18分离株CD2v胞外区基因序列,插入诺如病毒（No V）P颗粒的loop2中,组装成纳米颗粒,命名为CD2v蛋白纳米颗粒（P-CD2v）;以同样的方法将CD2v胞外区基因序列与载体相连后,命名为单体CD2v（CD2v）。重组CD2v蛋白进行真核表达后,用His Trap excel预装柱纯化,结果显示,P-CD2v蛋白的分子量大小约为110 k Da,单体CD2v蛋白的分子量大小约为75 k Da。经粒径测定,P-CD2v蛋白自发组装成粒径为19.9 nm的粒子,单体CD2v蛋白呈粒径为2.6 nm的粒子。2.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的制备及筛选以纯化后的重组CD2v蛋白作为免疫原,用相同的CD2v含量免疫小鼠,经间接ELISA检测结果显示,相比于单体CD2v蛋白,P-CD2v蛋白诱导小鼠产生更高水平的抗体滴度;与此同时,P-CD2v蛋白产生的腹水单克隆抗体效价更高,其中单克隆抗体10A3具有最高的抗体滴度,达到1:2048000;用单克隆抗体10A3制备CD2v抗体柱,具有较理想的偶联效率,为不含标签的CD2v蛋白的纯化提供更加便利快捷的方法。3.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的鉴定P-CD2v蛋白诱导产生的单克隆抗体具有更高的抗体效价和亲和活性,通过Dot-blot、IFA、IPMA对P-CD2v蛋白诱导产生的6株单克隆抗体进行鉴定。Dot-blot和IFA结果显示,筛选出的单克隆抗体能够结合重组CD2v蛋白;IPMA结果显示,6株单克隆抗体与感染ASFV HLJ/18分离株的甲醛固定细胞具有反应性,能够识别天然非洲猪瘟病毒;基于单克隆抗体的阻断ELISA实验结果显示,ASFV阳性血清均可阻断6株单克隆抗体与重组CD2v蛋白的反应,其中,单克隆抗体2E9对ASFV阳性血清的阻断抑制率最高,为84%,该单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,可用于非洲猪瘟检测方法的建立。4.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗原表位的鉴定Western blot结果显示,P-CD2v蛋白诱导产生的6株单克隆抗体与变性后的CD2v蛋白具有反应性,可用于线性表位的识别。根据预测的抗原表位和Ig超家族（Ig SF）相关结构域,对CD2v胞外区序列进行截短,将含有截断片段的质粒转染于HEK293T细胞,用于表位鉴定。本试验鉴定出CD2v胞外域序列第28-51位氨基酸的线性表位,并在模拟的CD2v蛋白结构上呈现截短表位的位置。综上所述,本研究制备出高免疫原性的CD2v蛋白纳米颗粒,并筛选高效价、高亲和活性的单克隆抗体,确定CD2v上一个抗原表位的精确定位,这些结果为ASFV病原学研究和血清学检测方法的建立提供帮助。