【摘 要】
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棉花（Gossypium spp.）是纺织业、食品、饲料的重要原材料,具有重要的经济价值。黄萎病是阻碍棉花提升品质和增加产量的重要原因,但目前尚未有根治方法。实践表明抗病最经济有效的措施是培育种植抗病品种,因此寻找高抗基因势在必行。有研究证明,木质素在黄萎病的抗病过程可通过阻碍病原菌的上传发挥重要作用。而基因GhDIRL几乎存在于所有维管植物中,是木质素合成路径中重要参与基因。因此本实验在团队前期
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棉花（Gossypium spp.）是纺织业、食品、饲料的重要原材料,具有重要的经济价值。黄萎病是阻碍棉花提升品质和增加产量的重要原因,但目前尚未有根治方法。实践表明抗病最经济有效的措施是培育种植抗病品种,因此寻找高抗基因势在必行。有研究证明,木质素在黄萎病的抗病过程可通过阻碍病原菌的上传发挥重要作用。而基因GhDIRL几乎存在于所有维管植物中,是木质素合成路径中重要参与基因。因此本实验在团队前期研究基础上,对19个以“冀棉11号”（简称J11）为背景材料的超表达GhDIRL株系进行了阳性筛选,得到了 15个阳性株系。对阳性株系进行拷贝数鉴定,最终筛选超表达株系12（Overexpression strain 12,简称OE-12）为后续研究材料,进一步开展转基因植物的抗病表型、基因表达、病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）等研究,对GhDIRL基因功能进行了验证和解析。主要研究结果如下:1.15个转基因株系GhDIRL表达量分析结果显示,相比对照,转基因株系中GhDIRL表达量均有明显提升,其中单拷贝株系OE-12、OE-15、OE-17中,OE-12表达量最高。2.接菌实验表型鉴定表明:接菌14d时,感病品种J11真叶大面积发黄,OE-12仅子叶发黄枯萎;接种30d时,OE-12发病明显轻于J11。病指统计分析表明:感病品种J11病指达到OE-12的4.15倍。病原菌恢复实验显示:OE-12病原菌茎段恢复生长数量远少于J11。以上结果提示,OE-12有效阻遏了病原菌的上传。3.利用VIGS技术抑制转基因材料GhDIRL的表达能有效降低棉花对黄萎病的抗性。接菌发现,与对照TRV:00相比,TRV:DIR叶片黄化、脱落更严重,且病指显著高于TRV:00。茎秆中黄萎病菌含量达到对照植株的2.67倍。4.利用qRT-PCR方法进一步分析了接菌后OE-12和感病品种J11根中与木质素、JA、SA、黄酮、棉酚合成路径相关的14个基因的表达。结果显示木质素合成路径相关基因在两种材料中均上调表达,但多数基因仅在OE-12中上调显著。JA、SA合成路径分析表明除JAZ1作为负调控因子有下降趋势,AOS、PR1、NPR1均显著上调且在OE-12中上调幅度更大。黄酮和棉酚合成相关基因CHS、CHI、DFR、TPS在OE-12中也都有更高的表达水平。5.JA、黄酮、PAL含量测定表明:与感病品种J11相比,OE-12接菌后JA、黄酮、PAL含量上升更明显。其中黄酮上升幅度较小,猜测黄酮可能不是参与棉花抗病的主要因素。6.木质素组织化学分析显示:接菌30d时,病毒诱导的TRV:DIR棉株中木质素被染色面积明显少于TRV:00植株。木质素含量测定显示:TRV:DIR棉株中木质素含量显著少于TRV:00。病原菌含量结果显示:TRV:DIR棉株病原菌相对含量却显著高于TRV:00。以上结论表明沉默基因GhDIRL后,下胚轴木质素含量明显减少,加重病原菌侵染。
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