【摘 要】
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YAP1的广泛生物学效应使其成为癌症治疗和再生医学中具有吸引力的靶点,虽然靶向hippo信号通路的抑制剂已有发现,但临床应用还具有挑战。高通量筛选为先导化合物的发现提供技术基础,分裂的纳米荧光素酶（NanoBiT）检测体系可以快速、准确定量细胞内带HiBiT标签的蛋白,是用于高通量筛选理想的检测体系。以RNP形式递送CRISPR/Cas9系统不仅可以实现快速编辑,还能提高靶点的编辑效率,同时还可以
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YAP1的广泛生物学效应使其成为癌症治疗和再生医学中具有吸引力的靶点,虽然靶向hippo信号通路的抑制剂已有发现,但临床应用还具有挑战。高通量筛选为先导化合物的发现提供技术基础,分裂的纳米荧光素酶（NanoBiT）检测体系可以快速、准确定量细胞内带HiBiT标签的蛋白,是用于高通量筛选理想的检测体系。以RNP形式递送CRISPR/Cas9系统不仅可以实现快速编辑,还能提高靶点的编辑效率,同时还可以降低脱靶风险。因此本文希望通过RNP递送CRISPR/Cas9,在YAP1 C端敲入HiBiT,建立基于纳米荧光素酶的高通量筛选模型,用于YAP1抑制剂的发现。首先,我们表达纯化了 EGFP、Cas9和T7RNA聚合酶,用EGFP建立RNP电转方法,并用T7 RNA聚合酶自主制备sgRNA。接着通过AAV（adeno-associated virus）或ssDNA递送敲入模板构建HiBiT敲入细胞系。通过对比我们发现以AAV递送敲入模板基因敲入效率更高。随后我们用实验证实NanoBiT检测体系可以快速检测细胞内YAP1-HiBiT蛋白表达量。利用这一模型我们从少量化合物中筛出4种可以抑制YAP1表达的化合物,并将它们用作高通量筛选的阳性对照。进一步,我们通过高通量筛选从1500种天然产物中发现24种具有潜在成为YAP1抑制剂的化合物。我们还将进一步阐明这些候选化合物的作用机制,从细胞和动物水平探究这些化合物的临床应用潜力。
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