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目的1通过检测宫颈脱落细胞中人乳头瘤状病毒（Human papillomavirus,HPV）感染状况,筛查宫颈病变早期患者。2将携带HPV18E6与E7融合基因的质粒转染Hela细胞,分析HPV18E6与E7融合基因对Hela细胞的影响,为HPV18型感染相关疾病的防治提供科学依据。方法1收集宫颈脱落细胞标本及其临床病理资料,应用荧光定量PCR法检测标本中15种高危型HPV感染状况,统计分析高危型HPV分布与临床病理特征的关系。2应用HPV L1区通用引物进行多聚酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）检测HPV感染状况,用HPV58 E6型特异性引物检测HPV58感染状况;应用荧光定量PCR检测HPV58 E6、E2及人管家基因β-actin的拷贝数,通过E2与E6比值确定HPV58整合状态;同时,应用HPV58癌基因转录扩增方法,分析整合型HPV58整合在宿主染色体的位置。3设计携带50bp巨细胞病毒Towne开放读码框55（Towne open Reading Frame 55,T-ORF55）左右同源臂的Gal K、HPV18E6E7野生型融合基因（HPV18Wild-type fusion gene,HPV18-w E6E7）,及HPV18E6E7突变型融合基因（HPV18Mutant-type fusion gene,HPV18-m E6E7）引物,经PCR扩增后产物切胶纯化处理;将片段Gal K电转至Towne细菌人工染色体（SW102Towne Bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC）感受态细胞,经Gal K和氯霉素筛选,得到SW102-T-ORF55-Galk-BAC克隆,并制备感受态细胞;分别将所得HPV18-w E6E7及HPV18-m E6E7电转至感受态细胞,在含有2-脱氧-半乳糖培养基中,通过同源重组及氯霉素抗性筛选,Gal K标记被HPV18-w E6E7与HPV18-m E6E7所替代,获得SW102-T-ORF55-HPV18-w E6E7-BAC及SW102-T-ORF55-HPV18-m E6E7-BAC的克隆,通过PCR验证质粒的正确性;将所得正确质粒DNA转染Hela细胞,通过逆转录PCR及测序分析验证融合基因的表达状况;显微镜下观察转染组（包括转染SW102-T-ORF55-HPV18-w E6E7-BAC、SW102-T-ORF55-HPV18-m E6E7-BAC及SW102-T-BAC）Hela细胞与未转染组Hela细胞的形态变化。利用软琼脂克隆实验和CCK8实验,检测构建的HPV18-m E6E7融合基因对肿瘤细胞的作用。结果1所收集的2605例宫颈脱落细胞标本中检出15种高危型HPV阳性标本725例,其中620HPV阳性标本发生了病理改变,高危型HPV阳性率随病变程度的加重而升高。2将1269例宫颈脱落细胞标本用HPVL1区引物检测到295例HPV阳性,用HPV58型特异性引物检测到34例标本HPV58阳性。通过HPV58阳性标本的整合状态分析,检测到4例为纯游离型,8例为纯整合型,22例为整合与游离的混合型;统计分析显示:宫颈病变程度与HPV58的病毒载量及整合状态无显著相关性;8例HPV58纯整合型标本,分别整合到患者1号,2号,5号,8号,17号染色体。3经PCR扩增获得1400bp Gal K、803bp HPV18-w E6E7及803bp HPV18-m E6E片段,经电转、重组及克隆筛选获得SW102-T-ORF55-HPV18-w E6E7-BAC及SW102-T-ORF55-HPV18-m E6E7-BAC的克隆。通过测序及逆转录PCR分析,证明转染的Hela细胞中突变型和野生型融合基因表达正确。倒置显微镜下进行形态学观察:转染了SW102-T-ORF55-HPV18-m E6E7-BAC的细胞出现了接触抑制,不能重叠生长。软琼脂克隆实验结果显示:稳定表达SW102-T-ORF55-m E6E7-BAC的Hela细胞组未见克隆形成;CCK8结果显示:稳定表达SW102-T-ORF55-HPV18-m E6E7-BAC的Hela细胞组生长速度比其他各组细胞生长速度要慢;表明HPV18-m E6E7对Hela细胞有抑制作用。结论1宫颈脱落细胞中,随宫颈病变程度的加重,高危型HPV阳性率呈上升趋势,提示可通过高危型HPV感染状况的检测,筛查早期宫颈病变患者。2高危型HPVE6与E7基因整合在宿主染色体是随机的。3所构建的HPV18突变型融合基因能够抑制HPV18阳性肿瘤细胞的生长。图 20 幅;表 10 个;参 149 篇。